الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الجسم الحي
June 26th, 2013
النقل إلى الوراء من صبغة الفلورسنت تسميات فرعية السكان من الخلايا العصبية على أساس إسقاط التشريحية. المحاور صفت يمكن استهداف بصريا في الجسم الحي، والسماح تسجيل خارج الخلية من المحاور التي تم تحديدها. هذا الأسلوب يسهل تسجيل عندما لا يمكن وصفها الخلايا العصبية من خلال التلاعب الجيني أو يصعب عزل باستخدام 'أعمى' في الجسم الحي النهج.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل استجابات الوحدة الواحدة في الجسم الحي من مجموعة محددة من الخلايا العصبية في نظام نموذج غير جيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء بضع القحف أولا لكشف منطقة الدماغ التي تهمك. الخطوة الثانية هي استخدام أسلاك التنغستن لوضع صبغة الفلورسنت في المنطقة التي تسقط عليها الخلايا العصبية المستهدفة.
بعد ذلك ، يتم نقل الصبغة إلى الوراء ، مما يؤدي إلى وضع العلامات الانتقائية على الخلايا العصبية الإسقاطية. الخطوة الأخيرة هي التسجيل من المحور العصبي المسمى للخلية العصبية الإسقاط الفردية. في النهاية ، يتم استخدام التسجيلات خارج الخلية أحادية الوحدة لإظهار كيفية استجابة الخلايا العصبية الحسية المركزية في دائرة سليمة للتحفيز الحسي في evo.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بكيفية اكتشاف الدوائر العصبية للاختلافات دون المللي ثانية في توقيت المدخلات المتشابكة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية هي القدرة على استهداف الخلايا العصبية الفردية أو حتى المحاور والأنظمة غير التي يمكن الوصول إليها وراثيا. تستخدم الأسماك الكهربائية الأسبوعية إشارات كهربائية للاتصال والملاحة.
يميزون الإشارات من الأسماك المختلفة باستخدام اختلافات أقل من الملي ثانية في توقيت المدخلات المتشابكة. سألنا كيف يمكن للخلايا العصبية المفترضة لمقارنة الوقت في دائرتها الحسية الكهربائية اكتشاف مثل هذه الاختلافات الصغيرة في التوقيت. ولكن يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى مثل المسارات الحسية البصرية والسمعية.
من الصعب بشكل خاص السوائل من هذه الخلايا بسبب صغر حجمها الكثيف الغارقة في الأنسجة المحيطة والمحطات قبل المشبكية التي تغطي معظم بطن الخلية حقن الصبغة داخل الخلايا أثناء تسجيل الخلية بأكملها. يقوم في المختبر بتسمية خلية واحدة لتوجيه التسجيلات المستهدفة من هذا المحور العصبي. وبالمثل ، يوفر النقل الرجعي بعد حقن الصبغة خارج الخلية وسيلة لوضع العلامات الانتقائية على الخلايا العصبية الإسقاط في مناطق الدماغ السطحية.
يمكن استخدام هذا لتوفير إرشادات مرئية لتسجيلات الوحدة الواحدة في الجسم الحي. لتحضير الإبرة المشفرة D ، قم أولا بشحذ سلك التنغستن بقطر 160 ميكرومتر إلى قطر طرف الإبرة النهائي من خمسة إلى 50 ميكرومتر. ثم في الليلة التي سبقت التجربة ، قم بترميز طرف الإبرة بمحلول مللي مولار من 10 ، 000 وزن جزيئي من ديكستران مترافق صبغة أرضية Alexa للحث على التخدير العام.
ضع الأسماك في مياه الخزان بمحلول MS 2 22 بمعدل 300 ملليغرام لكل لتر ، وقم بتثبيت الأسماك وإسكاتها كهربائيا عن طريق حقن 100 ميكرولتر من السائب بمعدل ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر في عضلات الجسم الظهرية. بعد ذلك ، املأ غرفة التسجيل بمياه الخزان وضع الجانب البطني للسمكة لأسفل على المنصة في وسط الغرفة. ثم قم بتوصيل محلول MS 2 22 الهوائي بمعدل 100 ملليغرام لكل لتر في واحد إلى ملليلترين في الدقيقة عن طريق وضع طرف ماصة في فمه.
بعد ذلك ، قم بتثبيت السمكة بقضبان ثابتة وشمع على جانبي الجسم. راقب الحالة الصحية للأسماك عن طريق التحقق من تدفق الدم المستمر في الأوعية الدموية ولون الجسم الطبيعي. ثم قم بتدوير المنصة على طول المحور الرأسي.
اضبط أحد طرفي المنصة بحيث ينكشف جانب واحد من السطح الظهري لرأس السمكة فوق الماء بينما يظل باقي جسم السمكة مغمورا. ضع قطعة صغيرة من مناديل كيم على أي جزء غير مغمور من الجلد لمنع الجفاف. في هذا الإجراء ، ضع 0.4٪ ليدوكائين على السطح المكشوف للرأس باستخدام Q-tip.
ثم استخدم شفرة مشرط لقطع قطعة مستطيلة من أنسجة الجلد يبلغ طولها حوالي ثلاثة ملليمترات × خمسة ملليمترات لسمكة يبلغ طولها 6.2 سم. يجب أن تتماشى الحافة الجانبية للمستطيل مع مركز العين. يجب أن تكون الحافة الأمامية للمستطيل خلف العين مباشرة ، ويجب أن تكون الحافة الإنسية للمستطيل جانبية لخط الوسط.
بعد ذلك ، قم بإزالة المستطيل باستخدام زوج من الملقط. قطع ميلي أمامي مربع إضافي 2.5 ملم لفضح الجمجمة. قم بتنظيف السطح المكشوف للجمجمة تماما عن طريق كشط أي أنسجة زائدة باستخدام شفرة المشرط.
ثم جفف السطح تماما بمسح كيم والهواء القسري. بعد ذلك ، قم بلصق عمود معدني على منطقة الجمجمة المكشوفة الإنسية الأمامية بالغراء الفائق. انتظر حتى يجف الغراء تماما.
استخدم مثقاب أسنان برأس كربيد مطحنة كروية قطره 0.5 مم لرسم مستطيل يبلغ طوله حوالي ملليمترين في أربعة ملليمترات على الجمجمة لسمكة يبلغ طولها 6.2 سم. بعد ذلك ، قم بقطع محيط المستطيل بالمشرط والملقط. ثم قشر الجمجمة بعيدا.
لفضح الدماغ ، قم بقص كل من الأم الجافية المصطبغة والأم الصافية باستخدام مقص زنبركي أو إبرة. ثم قم بإزالة الأجزاء المقطوعة باستخدام زوج من الملقط لكشف النواة الجانبية الأمامية الإضافية والنواة الجانبية الخلفية الإضافية. الآن ضع مناور بإبرة مطلية ب D تم إعدادها مسبقا فوق المنطقة المستهدفة التي تحتوي على المحاور ذات الأهمية.
تقوم النواة الجانبية الإضافية الخلفية في حالتنا بإدخال الإبرة بسرعة حوالي 25 ميكرومتر في الأنسجة. بعد انتشار الصبغة لمدة 15 إلى 30 ثانية ، اسحب الإبرة. كرر مع إبر جديدة إضافية حسب الحاجة.
ضع كل واحدة في مكان مختلف بحيث يتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء المنطقة المستهدفة. ثم اشطف الصبغة الزائدة من التجويف بمحلول هيكمان جرس وانتظر لمدة ساعتين على الأقل لامتصاص الصبغة ونقلها. لتصور المحاور ذات الأهمية ، ضع غرفة التسجيل مع السمكة أسفل هدف مجهر مضان epi ذو المرحلة الثابتة المستقيمة.
قم بتبديل محلول التنفس إلى مياه الخزان العذبة وحافظ على نفس معدل التدفق. ثم ضع أحد طرفي السلك الأرضي في تجويف الدماغ المكشوف وقم بتوصيل الطرف الآخر بأرض مرحلة رأس التسجيل. بعد ذلك ، ضع زوجا من أقطاب التسجيل بجوار قاعدة الذيل.
ثم قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمكبر للصوت التفاضلي وجهاز التسجيل. من أجل مراقبة أمر تفريغ الأعضاء الكهربائية أو EODC ، قم بإعداد رسم تخطيطي مصغر لمنطقة الدماغ التي يتم عرضها بتكبير منخفض ، بما في ذلك الأوعية الدموية الرئيسية كمعالم لتحديد الموقع الدقيق للمحاور المصنفة. لتأكيد الموضع D أولا ، اعرض الأنسجة بأكملها بإضاءة المجال الساطع للتوجيه.
ثم شاهده بإضاءة الفلورسنت. يجب أن تظهر النواة الجانبية الإضافية الخلفية ملصقات منتشرة. بعد ذلك ، تحت التكبير العالي ، حدد موقع النواة الجانبية الإضافية الأمامية مع الأوعية كمعالم.
قمبإضاءةه بضوء الفلورسنت أثناء البحث عن محور عصبي محدد بالقرب من السطح ، باستخدام قطر خارجي بقطر خارجي بقطر ملليمتر واحد 0.58 ملليمتر. زجاج شعري بو سيليكات مع خيوط. اسحب قطب تسجيل بساق ضيقة بطول خمسة ملليمترات وقطر طرف يتراوح من واحد إلى 2.4 ميكرومتر.
املأ القطب بمحلول رنين هيكمان المصفى. يجب أن تكون مقاومة الطرف النهائية في حدود 16 إلى 155 ميجا أوم. ضع القطب في حامل قطب كهربائي بمنفذ ضغط.
قم بتوصيله بمرحلة الرأس المثبتة على مناور. ثم قم بتوصيل مرحلة الرأس بمكبر للصوت. يقوم جهاز الاستحواذ التناظري إلى الرقمي غير المعروض بتوصيل مكبر الصوت بالكمبيوتر.
بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط إيجابي 30 مليبار على خط القطب. تقدم القطب ببطء نحو المحور العصبي من سطح الأنسجة. نظرا لأن القطب قريب من المحور العصبي ، يجب أن يتسبب الضغط الإيجابي في حركة طفيفة ولكن ملحوظة للمحور العصبي بينما يكون القطب بجوار المحور العصبي.
سجل النشاط أثناء عرض محفزات الاختبار. على الرغم من أن القطعة الأثرية الكهربائية تؤكد التسجيل والتحفيز المناسبين ، إلا أنه لا ينبغي أن تكون هناك إمكانات عمل. حرر الضغط الخارجي في القطب وكرر التحفيز والتسجيل.
ثم قم بتطبيق شفط طفيف مما يتسبب في تحرك المحور العصبي إلى القطب. كرر التحفيز والتسجيل مرة أخرى. الآن يجب أن ترى بعض إمكانات العمل استجابة للتحفيزات.
بمجرد أن تصبح إمكانات الفعل مرئية ، أغلق خط الضغط. عند اكتمال جميع التسجيلات المطلوبة ، قم بتحويل مياه الخزان مرة أخرى إلى محلول التنفس باستخدام MS 2 22 بمعدل مائة ملليغرام لكل لتر لضمان تخدير الأسماك تماما. لا ينبغي الكشف عن التخلص من مخاطر البضائع (EODC) لمدة 10 دقائق على الأقل قبل القتل الرحيم للأسماك.
فيما يلي خمسة آثار عينة توضح إمكانات الفعل التي أثارها 0.1 مللي ثانية ستة مللي فولت لكل سنتيمتر ، محفز نبض مربع عرضي إيجابي أحادي الطور ، وهنا مخطط نقطي يوضح أوقات الارتفاع خلال 20 تكرارا لنافذة تسجيل 75 مللي ثانية لنفس الوحدة المحفزة في بعض الأحيان صفر مع ستة مللي فولت لكل سنتيمتر محفزات. نطاق المدد مدرج على اليمين. يظهر هنا منحنى ضبط مدة التحفيز الذي يحدد الاستجابات على أنها طفرات لكل تكرار تحفيز.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الجراحة وحقن الصبغة الموضحة في هذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، ويمكن بدء التسجيلات بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات من حقن الصبغة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة صحة التجربة بعناية باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الفوتونين من أجل التسجيل من الخلايا العصبية في هياكل الدماغ الأعمق.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية وتسجيل استجابات وحدة واحدة من مجموعة محددة من الخلايا العصبية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتسجيل استجابات الوحدة الفردية من الخلايا العصبية المحددة في الجسم الحي باستخدام النقل الرجعي للصبغة الفلورية. تتيح هذه التقنية وضع العلامات الانتقائية على الخلايا العصبية الإسقاطية، مما يسهل التسجيلات خارج الخلايا المستهدفة في أنظمة النماذج غير الوراثية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربية
- الدوائر العصبية
الخلفية
- التسجيل من الخلايا العصبية المحددة أمر بالغ الأهمية لفهم الدوائر العصبية.
- قد لا تعمل الطرق التقليدية على وضع العلامات على الخلايا العصبية في الأنظمة غير الوراثية بشكل فعال.
- يمكن استخدام الصبغة الفلورية لوضع العلامات على الخلايا العصبية بناءً على إسقاطاتها التشريحية.
- يعد هذا النهج مفيدًا بشكل خاص لدراسة الخلايا العصبية الحسية في الأسماك الكهربائية.
هدف الدراسة
- تطوير تقنية للتسجيل في الجسم الحي من الخلايا العصبية المحددة.
- التحقيق في كيفية استجابة الخلايا العصبية الحسية للمنبهات.
- تعزيز القدرة على استهداف الخلايا العصبية الفردية في الأنسجة المعقدة.
الطرق المستخدمة
- فتح الجمجمة لكشف منطقة الدماغ المستهدفة.
- حقن الصبغة الفلورية في المناطق المستهدفة لوضع العلامات على الخلايا العصبية الإسقاطية.
- استخدام أسلاك التنغستن لوضع الصبغة بدقة.
- التسجيل خارج الخلايا من المحاور المصبوغة لتقييم الاستجابات العصبية.
النتائج الرئيسية
- وضع العلامات الناجح على الخلايا العصبية الإسقاطية باستخدام النقل الرجعي للصبغة.
- القدرة على تسجيل استجابات الوحدة الفردية من الخلايا العصبية المحددة.
- تم توضيح قابلية التطبيق التقنية لدراسة الاختلافات الزمنية في الدوائر الحسية.
- توفير التوجيه البصري للتسجيلات المستهدفة في الجسم الحي.
الاستنتاجات
- تتيح الطريقة التسجيلات المستهدفة من الخلايا العصبية المحددة في الأنظمة غير الوراثية.
- يمكن تطبيق هذا النهج على مسارات حسية مختلفة تتجاوز الأسماك الكهربائية.
- يوفر ميزة كبيرة على الطرق التقليدية في بيئات الأنسجة المعقدة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
