الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الجسم الحي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل استجابات الوحدة المنفردة في الجسم الحي من مجموعة محددة من الخلايا العصبية في نظام نموذجي غير جيني. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء عملية ثقب الجمجمة للكشف عن منطقة الدماغ المراد دراستها. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام أسلاك التنجستن لوضع الصبغة الفلورية في المنطقة التي تبرز إليها الخلايا العصبية المستهدفة.

بعد ذلك، يتم نقل الصبغة تراجعيًا، مما يؤدي إلى وسم انتقائي للعصبونات الإسقاطية. وتتمثل الخطوة النهائية في التسجيل من المحوار الموُسّم للعصبون الإسقاطي المنفرد. وفي النهاية، تُستخدم تسجيلات الوحدات المفردة خارج الخلوية لتوضيح كيفية استجابة العصبونات الحسية المركزية في دائرة سليمة للتحفيز الحسي في evo.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بكيفية اكتشاف الدوائر العصبية للفروق التي تقل عن الميلي ثانية في توقيت المدخلات التشابكية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في القدرة على استهداف عصبونات فردية أو حتى محاور عصبية، وكذلك الأنظمة التي لا يمكن الوصول إليها وراثياً. وتستخدم الأسماك الكهربائية الأسبوعية الإشارات الكهربائية للتواصل والملاحة.

فهي تميز الإشارات الصادرة عن أسماك مختلفة باستخدام فروق زمنية تقل عن الميلي ثانية في توقيت المدخلات المشبكية. وقد تساءلنا كيف تستطيع عصبونات مقارنة الوقت المفترضة في دائرة الاستشعار الكهربائي لديها اكتشاف مثل هذه الفروق الزمنية الضئيلة. كما يمكن تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى مثل المسارات الحسية البصرية والسمعية.

من الصعب بشكل خاص استخلاص السوائل من هذه الخلايا بسبب صغر حجمها وتداخلها الكثيف مع الأنسجة المحيطة والنهايات قبل المشبكية التي تغطي معظم جسم الخلية. يتم حقن الصبغة داخل الخلايا أثناء تسجيل الخلية الكاملة. في المختبر، يتم وسم خلية واحدة لتوجيه التسجيلات المستهدفة من ذلك المحور العصبي. وبالمثل، يوفر النقل الارتجاعي بعد حقن الصبغة خارج الخلية وسيلة لوسم العصبونات الإسقاطية في مناطق الدماغ السطحية بشكل انتقائي.

يمكن استخدام هذا لتوفير توجيه بصري لتسجيلات الوحدات المنفردة في الجسم الحي. لتحضير الإبرة المرمزة بـ D، قم أولاً بشحذ سلك تنغستن بقطر 160 ميكرومتر كهربائياً حتى يصل قطر طرف الإبرة النهائي إلى ما بين 5 و50 ميكرومتر. ثم في الليلة السابقة للتجربة، قم بترميز طرف الإبرة باستخدام محلول بتركيز 2 مليمولار من صبغة Alexa floor المقترنة بالديكستران بوزن جزيئي 10,000 لتحفيز التخدير العام.

ضع الأسماك في مياه الحوض التي تحتوي على محلول MS 2 22 بتركيز 300 milligrams per liter، ثم قم بتثبيت الأسماك وإسكاتها كهربائياً عن طريق حقن 100 µL من flail بتركيز 3 milligrams per mL في العضلات الظهرية للجسم. بعد ذلك، املأ غرفة التسجيل بمياه الحوض وضع السمكة بحيث يكون الجانب البطني للأسفل على المنصة الموجودة في مركز الغرفة. ثم قم بتوصيل محلول MS 2 22 المهوى بتركيز 100 milligrams per liter بمعدل 1 to 2 mL per minute عن طريق وضع طرف الماصة في فم السمكة.

بعد ذلك، قم بتثبيت السمكة باستخدام قضبان ثابتة وشمع على جانبي الجسم. راقب الحالة الصحية للسمكة من خلال التحقق من تدفق الدم المستمر في الأوعية الدموية العينية ولون الجسم الطبيعي. ثم قم بتدوير المنصة على طول المحور الرأسي.

قم بتعديل أحد طرفي المنصة بحيث يكون أحد جانبي السطح الظهري لرأس السمكة مكشوفاً فوق الماء بينما يظل باقي جسم السمكة مغموراً. ضع قطعة صغيرة من منديل Kim wipe على أي جزء غير مغمور من الجلد لمنع جفافه. في هذا الإجراء، يتم وضع 0.4% lidocaine على السطح المكشوف من الرأس باستخدام مسحة قطنية (Q-tip).

بعد ذلك، استخدم شفرة المشرط لقص قطعة مستطيلة من نسيج الجلد يبلغ حجمها حوالي 3 ملم في 5 ملم لسمكة طولها 6.2 سم. يجب أن تتماشى الحافة الجانبية للمستطيل مع مركز العين، بينما تكون الحافة الأمامية للمستطيل خلف العين مباشرة، والحافة الإنسية للمستطيل جانبية بالنسبة لخط المنتصف.

بعد ذلك، قم بإزالة المستطيل باستخدام ملقط. اقطع مربعاً إضافياً بمقاس 2.5 millimeter من الجهة الأمامية لكشف الجمجمة. قم بتنظيف السطح المكشوف من الجمجمة تماماً عن طريق كشط أي أنسجة زائدة باستخدام شفرة المشرط.

بعد ذلك، جفف السطح تماماً باستخدام منديل Kim وهواء مضغوط. بعد ذلك، قم بلصق عمود معدني في المنطقة المكشوفة من الجزء الإنسي الأمامي للجمجمة باستخدام الغراء الفائق. انتظر حتى يجف الغراء تماماً.

استخدم مثقاب أسنان مزوداً برأس كربيدي كروي بقطر 0.5 millimeter لرسم مستطيل تبلغ أبعاده حوالي اثنين millimeter في أربعة millimeter على جمجمة سمكة يبلغ طولها 6.2 centimeter. بعد ذلك، قم بقص محيط المستطيل باستخدام المشرط والملاقط، ثم انزع عظام الجمجمة.

لكشف الدماغ، قم بقص كل من الأم الجافية المصبغة والأم الحنكية الشفافة باستخدام مقص زنبركي أو إبرة. ثم قم بإزالة الأجزاء المقطوعة باستخدام ملقط لكشف النواة الجانبية الخارجية الأمامية والنواة الجانبية الخارجية الخلفية. الآن، قم بتمركز مناور مزود بإبرة مطلية بـ D تم تحضيرها مسبقاً فوق المنطقة المستهدفة التي تحتوي على المحاور العصبية المطلوبة.

في حالتنا هذه، يتم إدخال الإبرة بسرعة في النواة الخارجية الجانبية الخلفية بعمق 25 micrometers تقريباً داخل النسيج. بعد انتشار الصبغة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 ثانية، يتم سحب الإبرة. تكرر العملية باستخدام إبر جديدة إضافية حسب الحاجة.

ضع كل واحدة منها في موقع مختلف بحيث يتوزع الصبغ في جميع أنحاء المنطقة المستهدفة. ثم اشطف الصبغ الزائد من التجويف باستخدام محلول رينجر هيكمن، وانتظر لمدة ساعتين على الأقل للسماح بامتصاص الصبغ ونقله. ولتجسيد المحاور العصبية المستهدفة، ضع غرفة التسجيل التي تحتوي على السمكة تحت عدسة مجهر الفلورة فوق البنفسجية القائم ذو المنصة الثابتة.

استبدل محلول التنفس بمياه حوض جديدة مع الحفاظ على معدل التدفق نفسه. ثم ضع أحد طرفي السلك الأرضي في تجويف الدماغ المكشوف وقم بتوصيل الطرف الآخر بالأرضي في مرحلة رأس التسجيل. بعد ذلك، ضع زوجاً من أقطاب التسجيل بجانب قاعدة الذيل.

ثم قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمضخم تفاضلي وجهاز تسجيل. ومن أجل مراقبة أمر تفريغ العضو الكهربائي (EODC)، قم بإعداد رسم تخطيطي بمقياس رسم للمنطقة الدماغية عند عرضها بتكبير منخفض، مع تضمين الأوعية الدموية الرئيسية كعلامات استدلالية لتحديد الموقع الدقيق للمحاور العصبية المصبوغة. وللتأكد من وضع D أولاً، اعرض النسيج كاملاً باستخدام إضاءة المجال الساطع للتوجيه.

ثم قم بمعاينته باستخدام الإضاءة الفلورية. يجب أن تظهر النواة الجانبية الخارجية الخلفية وسمًا منتشرًا. بعد ذلك، وتحت تكبير عالٍ، حدد موقع النواة الجانبية الخارجية الأمامية باستخدام الأوعية الدموية كعلامات إرشادية.

قم بإضاءتها بضوء فلوري أثناء البحث عن محور عصبي مُوسوم بالقرب من السطح، باستخدام أنبوب شعري زجاجي من البوروسيليكات بقطر خارجي 1 mm وقطر داخلي 0.58 mm مع فتيلة. اسحب قطباً كهربائياً للتسجيل بساق ضيقة يبلغ طولها 5 mm وقطر طرف يتراوح بين 1 إلى 2.4 µm تقريباً.

املأ القطب بمحلول رينجر هيكمن المفلتر. يجب أن تكون مقاومة الطرف النهائية في نطاق يتراوح من 16 إلى 155 mega ohms. ضع القطب في حامل أقطاب يحتوي على منفذ ضغط.

قم بتوصيله بالمرحلة الرأسية المثبتة على جهاز تحريك دقيق. ثم قم بتوصيل المرحلة الرأسية بمضخم إشارات. ويقوم جهاز الحصول على البيانات التناظرية الرقمية (غير موضح في الشكل) بتوصيل المضخم بجهاز الكمبيوتر.

بعد ذلك، قم بتطبيق ضغط موجب قدره 30 millibar على خط القطب الكهربائي. حرّك القطب الكهربائي ببطء باتجاه المحور العصبي من سطح النسيج. وعندما يقترب القطب الكهربائي من المحور العصبي، يجب أن يؤدي الضغط الموجب إلى إحداث حركة طفيفة ولكن ملحوظة في المحور العصبي أثناء وجود القطب بجانبه.

سجّل النشاط أثناء تقديم محفزات الاختبار. وبالرغم من أن وجود أثر كهربائي يؤكد صحة التسجيل والتحفيز، إلا أنه يجب ألا تظهر أي جهود فعل. حرّر الضغط الخارجي في القطب الكهربائي وكرر عمليتي التحفيز والتسجيل.

ثم قم بتطبيق شفط خفيف يتسبب في تحريك المحور العصبي إلى داخل القطب الكهربائي. كرر عملية التحفيز والتسجيل مرة أخرى. من المفترض الآن أن ترى بعض جهود الفعل استجابةً لعمليات التحفيز.

بمجرد أن تصبح جهود الفعل مرئية، أغلق خط الضغط. وعندما تكتمل جميع التسجيلات المطلوبة، قم بتحويل مياه الخزان مرة أخرى إلى محلول التنفس الذي يحتوي على MS 222 بتركيز 100 mg/L لضمان تخدير السمكة بالكامل. يجب ألا يتم رصد أي EODC لمدة 10 دقائق على الأقل قبل تخدير السمكة حتى الموت.

تظهر هنا خمسة آثار عينة توضح جهود الفعل المستثارة بواسطة محفز نبضي مربع مستعرض موجب معاكس، أحادي الطور، بقوة ستة ميلي فولت لكل سنتيمتر ولمدة 0.1 millisecond، وهنا يظهر مخطط راستر يوضح أوقات الومضات خلال 20 تكراراً لنافذة تسجيل مدتها 75 millisecond لنفس الوحدة التي تم تحفيزها في الوقت صفر بمحفزات بقوة ستة ميلي فولت لكل سنتيمتر. تم إدراج نطاق المدد على اليمين. ويظهر هنا منحنى ضبط مدة التحفيز الذي يحدد كمية الاستجابات كعدد من الومضات لكل تكرار تحفيز.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراء الجراحة وحقن الصبغة الموضحة في غضون ساعة واحدة إذا نُفذت بشكل صحيح، ويمكن البدء في التسجيلات بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات من حقن الصبغة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة صحة الحيوان التجريبي بعناية بعد هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير ثنائي الفوتون من أجل التسجيل من العصبونات في هياكل دماغية أكثر عمقاً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية وتسجيل استجابات الوحدة المفردة من مجموعة محددة من العصبونات.