ميكروفلويديك الخلاطات لدراسة طي البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو خلط محلولين بسرعة لبدء تفاعل كيميائي حيوي على مقياس الميكروثانية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع خلاط مائع دقيق، ثم تتمثل الخطوة الثانية في ربط الشريحة بزجاج غطاء لإحكام غلق القنوات.

بعد ذلك، يتم تركيب الشريحة على مجمع يحتوي على خزانات المحلول. وتتمثل الخطوة النهائية في تصوير المحلول المخلوط باستخدام مجهر الفلورسنت confocal. وفي النهاية، يتم رصد التفاعل الكيميائي الحيوي على مقياس الميكروثانية عن طريق تحويل المسافة على طول قناة الخروج إلى زمن.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل خلط التدفق المتوقف، في أن عملية الخلط لا تحدها الاضطرابات وتحدث في غضون بضعة ميكروثوانٍ. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال طي البروتين، مثل متى يحدث الانهيار الكاره للماء؟ سيقوم لينغ وو، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح الإجراء لبدء تصنيع رقائق الخلط الموائعية الدقيقة.

أولاً، قم بتنظيف أربع رقاقات من السيليكا FU مقاس بوصة واحدة باستخدام محلول بيرانا طازج كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق بهذا الفيديو. بعد ذلك، استخدم فرن ترسيب البخار الكيميائي تحت ضغط منخفض لوضع طبقة من البوليسيليكون بسمك ميكرون واحد تقريباً لكل 10 ميكرون من العمق المستهدف للقنوات الموائعية الدقيقة النهائية. وبعد إجراء معالجة إضافية للرقاقات كما هو موضح في النص، قم بطلاء الرقاقات بطريقة التدوير بطبقة سمكها 900 نانومتر من مقاوِم الضوء Z 52 14، ثم قم بإجراء الخبز اللين عند 90 درجة Celsius مباشرة على لوح تسخين لمدة دقيقة واحدة أو في فرن عند 110 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة.

بعد محاذاة القناع الضوئي، قم بإجراء تلامس صلب وتفريغي عن طريق تعريض المقاوم الضوئي أولاً للأشعة فوق البنفسجية لعدة ثوانٍ. ثم قم بتظهير النمط في المقاوم الضوئي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. افحص المعالم الموجودة على الرقاقة باستخدام المجهر، ثم قم بالخبز الصلب عند 115 درجة Celsius مباشرة على لوح تسخين لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، قم بتنظيف الرقاقات من الملوثات العضوية (DCU) باستخدام جهاز Asher أو بلازما الأكسجين لمدة 2.5 minutes بقدرة تردد راديوي (RF power) تبلغ 100 watts. وباستخدام جهاز النقش الأيوني التفاعلي العميق، قم بنقش طبقة السيليكا المتعددة بالكامل وصولاً إلى السيليكا المصهورة الموجودة أسفلها. قم بإزالة ما تبقى من المقاوم الضوئي (photoresist) وعالج الرقاقة وفقاً للإرشادات الموضحة في النص.

قِس عمق النقش للتأكد من أنه قد نفذ بالكامل عبر طبقة البولي. باستخدام جهاز نقش أيوني تفاعلي عميق قادر على نقش الأكسيد، انقش السيليكا المنصهرة إلى عمق يبلغ تقريباً 10 ميكرون لكل ميكرون من سمك طبقة البولي. نظف الرقاقة باستخدام جهاز matrix Asher لمدة أربع دقائق، وبقدرة تردد لاسلكي RF تبلغ 100 واط، ثم أزل البوليسيليكون باستخدام جهاز نقش xenon di fluoride. قبل حفر الثقوب في الرقاقة، قم بطلاء طبقة جديدة من مقاوم الضوء بسمك ميكرون واحد باستخدام الطلاء الدوراني لحماية القنوات أثناء عمليات المناولة اللاحقة.

بعد ذلك، قم بتثبيت الرقاقة بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على المزايا متجهًا للأسفل على لوح زجاجي تضحوي باستخدام Aqua Bond 55. مع الحرص على إبقاء مادة الربط خالية من الفقاعات، استخدم مثقابًا بقمة ماسية يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر مع محلول تنظيف micro 90. وهذا يمنع التصاق قطع الزجاج الصغيرة بالقنوات، والتي قد تؤدي لاحقًا إلى انسداد الشريحة أثناء الاستخدام.

باشر بحفر ثقوب الدخول والخروج في كل شريحة. اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات باستخدام حقنة لحقن الماء في كل ثقب. ثم انقعها في ماء وصابون لمدة ساعة بعد إزالة المادة الحساسة للضوء.

ضع مادة المقاوم (resist) والمادة الرابطة (bonder) كما هو موضح في النص. اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات والماء الدافئ والصابون. اشطف كل ثقب مرة أخرى باستخدام سرنجة، مع تجنب الملامسة للميزات المحفورة بعد تمرير النيتروجين فوق الرقاقة.

استمر في التجفيف داخل فرن تفريغ مضبوط على 120 درجة Celsius. افحص الثقوب للتأكد من خلوها من الشوائب وكرر خطوات التنظيف حسب الضرورة. يجب تنفيذ الخطوات التالية في الغرفة النظيفة.

قم بقياس عمق القنوات باستخدام جهاز تحليل تضاريس السطح البصري أو الميكانيكي. نظف الرقاقة وكذلك غطاء زجاجي من السيليكا المصهورة كما هو موضح في النص داخل غرفة نظيفة. جفف الرقاقة تماماً باستخدام غاز النيتروجين لمدة خمس دقائق على الأقل.

بعد ذلك، ضع الرقاقة بحيث يكون الوجه الذي يحتوي على الميزات للأعلى فوق كومة من ثلاث إلى أربع من مناديل الغرفة النظيفة الموضوعة على سطح صلب ومستوٍ، مثل لوح زجاجي صغير. كرر العملية مع غطاء الزجاج. ارفع غطاء الزجاج من الحافة واقلبه بحيث يكون الجانب المصقول موجهاً لأسفل فوق الرقاقة.

قم بمحاذاة الحواف المسطحة بعناية، ثم أسقط شريحة الغطاء على الرقاقة واتركها تستقر، مع تحريكها أفقيًا فقط لضبط المحاذاة. اضغط بإصبع واحد على مركز الرقاقة، حيث يجب أن تلاحظ بدء انتشار جبهة الترابط نحو الخارج.

إذا لزم الأمر، يتم تطبيق ضغط إضافي على مواضع أخرى حول الرقاقة لدفع جبهة الربط. بعد وضع الرقاقات المختومة في فرن عالي الحرارة مبرمج وفق ملف درجة الحرارة المدرج في النص، تُقطع الرقاقة باستخدام منشار تقطيع الرقاقات إلى شرائح فردية. يمكن صنع المجمع الذي يحمل شريحة الخلط والمحاليل من البلاستيك مثل ليكسان أو بليكسي جلاس، أو من الألمنيوم.

للتحكم في درجة الحرارة، قم بتثبيت الشريحة في المجمع باستخدام حلقات دائرية (o-rings) صغيرة، وثبتها في مكانها باستخدام حلقة تثبيت تسمح برؤية بصرية واضحة لمركز الشريحة. يجب أن تكون أخاديد الحلقات الدائرية أقل عمقاً من المعتاد لضمان التوافق الجيد دون تسليط ضغط مفرط على الشريحة. وبمجرد تركيب الشريحة، أضف المحاليل إلى الخزانات المركزية والجانبية، مع الحرص على تحرير أي فقاعات محتبسة في قاع الآبار.

ضع المجمّع على مجهر مقلوب وافحص منطقة الخلط باستخدام العدسة العينية أو مخرج الكاميرا. سيوفر مصباح يدوي متوهج يوضع فوق المجمّع إضاءة كافية. استخدم صبغة أو محلولاً ذا معامل انكسار عالٍ في القناة المركزية لرؤية النفث.

نظرًا لأن الأحجام المستخدمة في هذا المازج صغيرة جدًا، يمكن التحكم في التدفق بواسطة ضغط الهواء المطبق فوق آبار المحلول. ولتصوير النفث، ابدأ بضغط القناة الجانبية عند صفر رطل لكل بوصة مربعة وزده ببطء حتى يتساوى الضغط مع القناة المركزية. وإذا كانت إحدى القنوات الجانبية مسدودة، فسيتم دفع النفث باتجاه أحد جدران قناة المخرج.

إذا ظهر انسداد مرئي، يمكن إزالته عن طريق تسليط ضغط أو تفريغ هوائي على قناة الخروج باستخدام حقنة. وفي حالة انسداد الشريحة بالبروتين أو أي مواد عضوية أخرى، يمكن تنظيفها عن طريق النقع في محلول بيرانا طوال الليل. يتم توجيه شعاع ليزر مطلي إلى مجهر بحثي باستخدام مرآة ثنائية اللون سواء كانت داخل المجهر أو خارجه مباشرة.

قم بمحاذاة الليزر بحيث يمكن رؤية بؤرة التركيز في العدسة العينية أو الكاميرا بالقرب من منطقة الخلط إلى حد ما. يتم تجميع الفلورة الصادرة من البروتين في الخلاط بواسطة الشيئية وإرسالها عبر المرآة ثنائية اللون، حيث يتم تركيزها بواسطة عدسة إلى ثقب صغير وتصويرها على عداد فوتونات. قم بمسح الشريحة باستخدام ماسح ضوئي بيزوكهربائي في المحورين x و y لتصوير منطقة الخلط.

اختر موضعاً على النفث وقم بالمسح في المحورين X و Y للعثور على البؤرة في مركز القناة رأسياً. إن عمق المجال للمجهر أقل بكثير من عمق القناة، ومعدل التدفق منتظم في القناة باستثناء مسافة ميكرون واحد من الجدران. وبناءً على ذلك، يتم تحديد الدقة الزمنية للفلورة المرصودة بشكل أساسي من خلال حجم البقعة البؤرية (confocal spot).

قم بإجراء مسح أفقي داخل قناة الخروج بزيادات قدرها 100 micron على طول النفاث مع المراقبة لمدة ميلي ثانية واحدة تقريباً لكل موضع. حرك منصة المجهر بمقدار 80 إلى 90 micron على طول النفاث لالتقاط الأوقات اللاحقة. وبدلاً من ذلك، يمكن الكشف عن الضوء بواسطة مطياف وكاشف CCD بعد المرآة ثنائية اللون باستخدام عدسة لتركيز الضوء على شق الدخول.

بما أن عملية جمع البيانات أبطأ مقارنةً بما هي عليه في عداد الفوتونات، فعادةً ما يتم تصوير النفاث أولاً باستخدام عداد الفوتونات، ثم تُقاس النقاط على طول النفاث باستخدام المطياف. تُحلل البيانات الواردة من عداد الفوتونات عن طريق جمع ثلاثة إلى خمسة بكسلات حول النفاث عند كل موضع لإنشاء مخطط يوضح الشدة مقابل المسافة. ويتم حساب الوقت من المسافة باستخدام سرعة محسوبة بناءً على الضغوط المطبقة.

كخطوة أخيرة، قم بتحليل البيانات الناتجة عن المخطط الطيفي باستخدام إحدى الطرق الموضحة في النص. يظهر هنا مخطط كفافي لشدة المنطقة الممزوجة المقاسة بواسطة عداد الفوتونات. يجب أن تكون الخلفية في قناة الخروج خارج النفث قريبة من مستوى الضوضاء الخاص بالكاشف، وعادةً لا يتم طرحها.

قد تشير الخلفية المرتفعة إلى ضعف في المحاذاة أو أن البروتين يلتصق بجدران القناة. وعلى العكس من ذلك، فإن النفاث الذي يبدو ملتوياً أو مائلاً، خاصة بالقرب من منطقة الخلط، يشير إلى عملية حفر رديئة للفوهات. يظهر هنا طيف بدقة زمنية للبروتين ACell coenzyme a binding protein أو A CBP المسمى بـ Alexa 4 88 و Alexa 6 47.

توضح المستطيلات الخضراء والحمراء الأطوال الموجية المخصصة لقناتي المانح والمستقبل على التوالي. وقد تم طرح الخلفية من هذه البيانات لإزالة شحنة الظلام وإشارة الليزر. تم أخذ إشارة الخلفية مع ضبط ضغط القناة المركزية عند صفر pounds per square inch.

يمكن قياس زمن المزج عن طريق قياس تفاعل سريع يكون أسرع بكثير من عملية المزج، مثل إخماد فلورة التربتوفان بواسطة يوديد البوتاسيوم. ونظراً لأن النفاثة أصغر من الدقة البصرية للمجهر، يحدث انخفاض كبير في الشدة في منطقة المزج. وعندما تتشكل النفاثة، يمكن إزالة استجابة الجهاز هذه من خلال إجراء قياس ضابط لا تتغير فيه ظروف المحلول.

يُظهر هذا الشكل النسبة بين تجارب الخلط وعدم الخلط لفلورة N-Acetyl tryptophan amide. يمثل الخط التركيز المتوقع ليوديد البوتاسيوم بناءً على نمذجة ومحاكاة COMSOL multiphysics. أما زمن الخلط، مقاساً بالوقت اللازم لانخفاض التركيز بنسبة 80%، فهو ثماني ميكروثانية.

يوضح هذا المخطط تغيرات fret في البروتين A CBP بعد تخفيف المادة الممسخة من 6 molar إلى 0.06 molar. لا تتطلب هذه البيانات تجربة ضابطة. ونظرًا لأن fret يمثل بالفعل نسبة وقد تمت إزالة استجابة الجهاز، فإن القفزة السريعة بالقرب من T تساوي صفر تمثل تغيرًا سريعًا في إشارة fret خلال وقت الخلط.

بعد هذا التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طي البروتين لاستكشاف الخطوات الأولى في تكوين بنية البروتين.