إنشاء الميكروبية إثراء الثقافات حقيقية النواة من بحيرة القطب الجنوبي الطبقية كيميائيا وتقييم القدرة على تثبيت الكربون

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مستنبتات إثراء للطلائعيات من بحيرة بوني في القارة القطبية الجنوبية، وقياس تثبيت الكربون كجزء من مؤشر أولي للتنوع الأيضي. يتم تحقيق ذلك من خلال أخذ عينات أولاً من أعماق مياه بحيرة بوني التي تتوافق مع ذروات معروفة للطلائعيات والعوالق النباتية. ثم يتم تلقيح عينات مياه البحيرة في أوساط نمو مختلفة وتحضينها في غرفة نمو مجهزة بمنظم درجة حرارة وإضاءة لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أسابيع.

يمكن نقل المزارع حسب الحاجة في درجة حرارة أربع درجات مئوية. الخطوة التالية هي استخلاص نواتج تحلل الخلايا الخام من مزارع الإثراء. الخطوة النهائية من هذا الإجراء هي تقييم إمكانية تثبيت الكربون في ناتج تحلل الخلايا باستخدام مقايسة النظائر المشعة لإنزيم ريبولوز-1،5-ثنائي الفوسفات كاربوكسيلاز/أكسجيناز، أو نشاط Rubis co.

وفي الختام، تُظهر مستنبتات الإثراء الأولية تباينًا في إمكانيات تثبيت الكربون ضمن المجتمع البروتوزوي الطبيعي. ومن شأن هذه الطريقة أن تساعدنا في الإجابة على أسئلة جوهرية تتعلق بالايكولوجيا الميكروبية للبحيرات، مثل دور حقيقيات النوى الميكروبية في دورة الكربون عبر الخطوات المختلفة في البحيرات القطبية الجنوبية الطبقية.

على الرغم من أن أخذ عينات من عمود الماء لأجيال لاحقة من مزارع الإثراء هي تقنية مستخدمة بشكل متكرر، إلا أن هذه الطريقة تتضمن تعديلات للعمل في بيئة شديدة البرودة حيث يمكن أن تحدث تعقيدات غير متوقعة. لقد خطرت لي هذه الفكرة لهذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أفكر في طرق لاختبار مقايسة Redisco في عينات من بحيرة طبيعية. ويعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات أخذ العينات يصعب تخيلها نظراً لأن مواقع أخذ العينات تقع في بيئة غريبة بالنسبة للعديد من الباحثين.

تُجمع العينات من بحيرة بوني (Lake Bonnie)، وهي إحدى البحيرات العديدة المغطاة بالجليد بشكل دائم والموجودة في وديان ماكموردو الجافة في القارة القطبية الجنوبية. قبل يوم واحد من أخذ عينات من العمود المائي، اختر موقع أخذ العينات وقم بتجهيزه؛ حيث سيسمح ذلك للطبقات المتدرجة في العمود المائي بإعادة التشكل بعد الاضطراب الناجم عن الحفر وصهر الثقب الجليدي. حدد موقع موقع الحفر باستخدام نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) للوصول إلى العمود المائي.

ابدأ بحفر ثقب عبر الجليد باستخدام مثقاب Jiffy Ice متصل بتمديد Jiffy flight بطول أربع بوصات وبت قطع لمنع تجمد المثقاب داخل الثقب. حاول تجنب الحفر في المياه السائلة من خلال إيقاف عملية الحفر على ارتفاع يتراوح بين أربع إلى ست بوصات تقريبًا فوق قمة عمود الماء. يجب توسيع ثقب الحفر من قطر ست بوصات إلى قدمين لأغراض أخذ العينات.

يتم إنجاز ذلك باستخدام جهاز صهر ثقوب نموذج البحر الساخن الذي يقوم بتدوير بولي إيثيلين جلايكول مسخن عبر ثقب أنبوب نحاسي. وعادة ما تستغرق عملية الصهر ما يصل إلى 18 ساعة في اليوم السابق لأخذ عينات من العمود المائي. تأكد من تجميع كافة المعدات المطلوبة وأوعية تخزين العينات في موقع أخذ العينات.

تشمل مواد أخذ العينات زجاجة NICU بسعة تتراوح من 5 إلى 10 لتر، وونش مزود بكابل معاير للعمق، وعدد كافٍ من زجاجات العينات لكل عمق أخذ عينات، ومرسال (messenger)، ومبردات لنقل العينات. ابدأ عملية أخذ العينات في وقت مبكر من اليوم في حوالي الساعة 5:00 صباحاً، حيث يجب إتمام عملية ترشيح مياه البحيرة في يوم أخذ العينات. استخدم جهاز أخذ عينات من نوع kin مثبت بونش يدوي معاير.

اجمع عينات مياه تتراوح سعتها من لتر واحد إلى خمسة لترات من الأعماق المطلوبة لهذه الدراسة. وأعماق أخذ العينات هي 6 أمتار، و15 مترًا، و18 مترًا مقاسة من مستوى المياه المتماثل (PI) في ثقب الجليد. تُحفظ عينات البحيرة في مبردات وتُنقل من موقع أخذ العينات إلى المختبر الميداني.

باستخدام زلاجة مثبتة في A TV، يجب معالجة العينات أو تثبيتها في المختبر الميداني. وفور الانتهاء من أخذ العينات، يجب البدء في استزراع مزارع الإثراء بمجرد نقل العينات إلى المختبر الميداني. يتم تركيز 0.5 إلى لتر واحد من مياه البحيرة على مرشح بقطر 47 millimeter ومسامية 0.45 micron.

مرشحات بولي إيثر سلفون باستخدام الترشيح اللطيف. إذا كانت هناك رغبة في معرفة تنوع المجتمع الطبيعي، يتم ترشيح عينة ثانية على غشاء بقطر 47 مليمتر وبحجم مسام 0.45 ميكرون.

قم بتجميد مرشحات البولي إيثر سلفون (POLYETHERS sulfone) تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل. انقل كل مرشح إلى أنبوب فالكون معقم سعة 50 مل يحتوي على حوالي 20 مل من مياه البحيرة المفلترة، والتي تم جمعها من نفس عمق أخذ العينات الذي سُحب منه المرشح.

انقل معلق الخلايا إلى دورق زراعة خلايا معقم بمساحة 25 سنتيمتر مربع من أجل الإثراء في أوساط زراعية مختلفة. قم بإعداد مكررات متعددة لكل عمق أخذ عينات. أضف إلى كل دورق زراعة 50 x من المحاليل المعقمة لأوساط الزراعة التالية: bold basil، وmedium، وBG 11، وF two.

إذا كانت زراعة الكائنات مختلطة التغذية مطلوبة، فقم بتجهيز وعاءين مكملين بوسط F two وأضف حبتين إلى ثلاث حبات من الأرز المعقم إلى أحد دوارق استنبات المزارع في درجة حرارة منخفضة وإشعاع أقل في حاضنة نمو يتم التحكم في درجة حرارتها لمدة أربعة أسابيع على الأقل قبل الشحن إلى المختبر في الولايات المتحدة. انقل مزارع الإثراء إلى أنابيب Falcon معقمة سعة 50 milliliter. اطلب متطلبات الشحن "عدم التجميد" و"الحفاظ على البرودة" في طلب الشحن. عند الوصول إلى الولايات المتحدة، انقل 5 milliliter من كل مزرعة إثراء إلى 45 milliliter من وسط النمو المناسب في وعاء سعة 125 milliliter.

دورق إرلينماير معقم مغلق بسدادة إسفنجية معقمة. يتم الحفاظ على مزارع الإثراء كمزارع ساكنة في غرفة نمو بيئية يتم التحكم في درجة حرارتها عند 4 °C، ويتم نقل المزارع إلى أوساط غذائية جديدة كل 30 يوماً. لبدء إجراء استخلاص محلل الخلايا، يتم ترشيح 5 L من مزرعة الإثراء على مرشح Watman GFF بقطر 25 mm باستخدام تفريغ هواء خفيف.

بعد ذلك، قم بقص المرشح إلى أربعة أو خمسة أقسام باستخدام مقصات فولاذية معقمة. ثم استخدم ملقطاً معقماً لنقل القطع إلى أنبوب ذو غطاء لولبي سعة 2 مل، مملوء إلى خُمس سعته بسائل بقطر 0.1 ملم.

خرزات الزركونيا والسيليكا. أضف 1.25 milliliters من منظم استخلاص المرشح إلى الأنبوب، ثم قم بتفتيت الخلايا باستخدام جهاز تفتيت الخرز الصغير (mini bead beader) لمدة 30 seconds على إعداد سرعة 48، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة one minute. كرر عملية تفتيت الخرز مرتين إضافيتين مع تحضين على الثلج لمدة one minute بين كل عملية تفتيت لمنع تسخين العينة في جهاز الطرد المركزي.

قم بترشيح المعلق لمدة دقيقتين عند 3000 ×g في درجة حرارة 4 °C، وذلك لتكوين طبقة رخوة من ألياف مرشح GFF وبقايا الجدار الخلوي. قم بإزالة كمية مقدارها 200 µL من الراسب وغمرها في 800 µL من الأسيتون بتركيز 90% المبرد بالثلج.

انقل ما تبقى من السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. قم بقياس الكلوروفيل A القابل للاستخلاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند أطوال موجية تبلغ 664 nanometers و 647 nanometers. قم بطرد السائل الطافي المتبقي مركزياً لمدة دقيقتين بسرعة 15,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C.

انقل الـ S إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 milliliter مع تجنب نقل الكتلة المترسبة من الأغشية الخلوية غير الذائبة وألياف مرشح GFF المتبقية. يمكن الآن استخدام هذه المادة الخلوية المتحللة الذائبة في مقايسة نشاط روبيس كاربوكسيليز، والتي سيتم توضيحها لاحقاً. لبدء هذه المقايسة، انقل 125 microliters من كل محلول تحلل ذائب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ذو غطاء لولبي يكون قد تم تبريده على الثلج.

بالنسبة لعينات الضابط السلبي، أضف 125 µL من المستخلص الذائب إلى أنبوب طرد مركزي صغير ذو غطاء لولبي سعة 1.5 mL، ولكن لا تضف المادة الخاضعة للتفاعل. لاحقاً، قم بإجراء تفاعلات مكررة لجميع العينات والضوابط السلبية. قم بتحضير 10 mL من محلول منظم للمقايسة، على أن يكون طازجاً ومبرداً على الثلج.

ضع كمية كافية من منظم المقايسة لجميع العينات والضوابط السلبية في أنبوب سعة خمسة ملليلتر. ومن هذه النقطة فصاعداً، يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت خزانة استخلاص الأدخنة. أضف بيكربونات الصوديوم المسمى بـ C 14 إلى المنظم المخصص وحافظ على المنظم مبرداً على الثلج.

قم بإزالة 10 µL من منظم المقايسة الذي يحتوي على C 14 وقم بتخفيفه في 1 mL من منظم المقايسة مع القلب للخلط. أضف 100 µL من الخليط المخفف إلى 3 mL من كوكتيل عد الوميض bios safe two في قارورة وميض، ثم اقلب القارورة للخلط. قم بقياس عدادات C 14 باستخدام عداد Beckman LS 6, 500، ويجب أن تتجاوز عدادات الوميض 18,000 عدة في الدقيقة قبل المتابعة في المقايسة.

عند إضافة كمية كافية من بيكربونات الصوديوم الموسومة بـ C 14 إلى منظم المقايسة، انقل أنابيب التفاعل إلى حمام جاف، تم ضبطه مسبقاً على 25 درجة Celsius واتركها للحضن لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 100 µL من منظم المقايسة إلى النواتج المحللة واحضنها عند 25 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. وبعد مرور خمس دقائق، أضف ريبولوز ثنائي الفوسفات إلى كل عينة واترك التفاعل يستمر لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند 25 درجة Celsius.

لإيقاف التفاعل، أضف 100 µL من حمض البروبيونيك بتركيز 100%، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ساعة واحدة عند 2000 ×g للتخلص من C 14 غير المدمج. وأخيرًا، انقل الحجم الكلي للعينات إلى قوارير وميض تحتوي على 3 mL من سائل وميض Bios Safe 2، ثم حدد عدد النبضات في الدقيقة من الكربون المستقر.

تحديد النواتج النهائية عن طريق العد الومضي. استُخدم الاستنبات الإثراؤي لعزل طلائع ضوئية التغذية ومختلطة التغذية جديدة ومتكيفة مع البرودة من بحيرة بوني في القارة القطبية الجنوبية من ثلاثة أعماق مختلفة. استُخدمت أنواع مختلفة من أوساط النمو لاختيار تنوع أكبر من الكائنات الحية، وهي: وسط بolds، ووسط basil (BBMF two si)، والوسط البحري، ووسط BG 11.

تمثل تركيزات العناصر الغذائية والإشعاع النشط ضوئياً أو PAR الموضحة في هذا الجدول الظروف السائدة وقت جمع العينات. وكشف الفحص البصري لمزارع الإثراء باستخدام المجهر الضوئي أن المزارع كانت تهيمن عليها الطلائعيات ذات التغذية الضوئية، كما يتضح من وجود صبغة الكلوروفيل في معظم الخلايا. كما احتوت المزارع أيضاً على مجموعة متنوعة من المورفولوجيات الخلوية بناءً على عمق أخذ العينات الذي استُخلص منه اللقاح ونوع الوسط المستخدم في المزرعة.

تم قياس المعدلات القصوى لنشاط الكربوكسيلاز الذي يحفزه إنزيم rubis في المزارع المثرية كبديل لقياس تثبيت الكربون. كما تمت مراقبة وفرة الكلوروفيل a كتقدير للكتلة الحيوية للطلائيات ذات التغذية الضوئية كما هو موضح هنا.

على الرغم من استزراع جميع المزارع تحت درجة الحرارة ونظام الإضاءة ذاتهما، إلا أن إمكانية تثبيت الكربون والكتلة الحيوية ذات التغذية الضوئية تباينت بشكل كبير بين مزارع الإثراء. وقد لوحظ أقصى نشاط لإنزيم rubis O في مزارع الإثراء الرابعة والسادسة التي نمت في أوساط BBM، ومزارع الإثراء 13 و14 التي نمت في أوساط BG 11. وفي المقابل، أظهرت المزارع 1921 و23 التي تم إثراؤها في وسط نمو F two أقصى أنشطة لإنزيم الكربوكسيلاز كانت أقل بمقدار يتراوح من 4 إلى 34 ضعفاً.

ولم تكن هذه الاختلافات تعود إلى انخفاض مستويات الكتلة الحيوية في مستنبتي F two، حيث تم التعبير عن نشاط الكربوكسيليز بناءً على تركيز الكلوروفيل a. علاوة على ذلك، كشف تحليل ارتباط بيرسون أن نشاط rubis co لم يرتبط بتركيز الكلوروفيل a. تم تلقيح مستنبتات BBM بمياه البحيرة المأخوذة من عمق ستة أمتار و15 متراً.

سجلت المجموعة الخامسة في عملية الإثراء أعلى مستويات chlorophyll A، بينما أظهرت جميع المزارع الأخرى مستويات منخفضة نسبياً من chlorophyll a بغض النظر عن نشاط إنزيم rubis. وبمجرد إتقانها، تستغرق تقنيات أخذ عينات البحيرة حوالي ساعتين للتنفيذ. وبناءً على عدد العينات التي يتم جمعها، يستغرق مقايسة carboxylase ساعتين أيضاً عند إجرائها بشكل صحيح. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل مقايسة نشاط الإنزيم غير ذاتي التغذية (heterotrophic) للإجابة على أسئلة إضافية مثل العمق الذي تتواجد فيه الكائنات غير ذاتية التغذية. حسناً، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع عينات البحيرة، وإثرائها لإنتاج ومقايسة نشاط rubis carboxylase.