استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي
سبتمبر 1, 2012
يوصف هنا نهج الروبوتية إلى الإنتاجية العالية بلورة البروتينات الغشاء في mesophases شحمي لاستخدامها في تصميم هيكل الجزيئات باستخدام الأشعة السينية البلورات. وقدم ثلاثة روبوتات قادرة على التعامل مع لزجة لزجة والبروتين لادن mesophase جزءا لا يتجزأ من أسلوب.
مرحبا ومرحبا بكم في مجموعة البيولوجيا الهيكلية والوظيفية للغشاء. اسمي مارتن كافيري. هذا آخر في سلسلة من JO من المقالات حول بلورة بروتينات الغشاء للتحديد المنظم باستخدام طريقة الطور المكعب في الميزو أو الدهون.
في المقالة الأولى ، JoVE 1 7 1 2 ، أوضحنا كيف يتم تحضير المرحلة المكعبة المحملة بالبروتين وكيف يتم توزيع مرحلة ميسا اللزجة واللزجة يدويا في ألواح شطيرة زجاجية لتجارب التبلور. ستصف مقالة الفيديو هذه طرق استخدام روبوت البلورة المتوسطة. يوفر الروبوت مزايا السرعة والدقة والتصغير الدقيق والقدرة على العمل لفترات طويلة في ظل ظروف غير مريحة مثل الظلام أو في درجات الحرارة المنخفضة.
يمكنللروبوتات عند استخدامها بشكل صحيح أن تحسن بشكل كبير من إنتاجية بنية البروتين الغشائي وأبحاث الوظيفة. في مقالة الفيديو هذه ، نوضح استخدام ثلاثة روبوتات متاحة تجاريا. تم تطوير الروبوت الأول في مجموعة البيولوجيا الهيكلية والوظيفية للغشاء ، وتم وصفه بالتفصيل في المرجع الأول.
أصبح الاثنان الآخران متاحين مؤخرا ويتم تضمينهما هنا من أجل الاكتمال. يبدأ إعداد لوحة البلورة لإجراء تجربة البلورة آليا بإعداد اللوحة الأساسية للوحة بلورة الساندويتش الزجاجية الموصوفة بالتفصيل في إشارة إلى لوحة القاعدة ويجب أولا تطبيق فاصل العصا المزدوجة المثقوب الذي يخلق الآبار على اللوحة. المواد اللازمة لهذا موضحة هنا.
وهي تشمل لوحة قاعدة تبلور زجاجية ، ومحلول فاصل مزدوج العصا مثقب ، ومناديل ورقية أسطوانية أو براير ، ودورق من ماء UE. يتم وضع اللوحة على منشفة ورقية على سطح مقعد. يتم تطبيق بضع قطرات من المحلول الصامت ثم توزيعها بالتساوي على سطح اللوحة بمنديل ورقي.
يتم غسل اللوحة من محلول الإزالة الزائد عن طريق غمرها بالكامل في كوب من الماء. تتم إزالة اللوحة من الدورق الموضوعة على منشفة ورقية جافة. يتم تجفيف الجانب الموزع لأعلى وسطحه المكشوف عن طريق المسح برفق بالمناشف الورقية.
بعد ذلك ، تتم إزالة الغطاء الواقي على فاصل العصا المزدوجة المثقوب ويتم تطبيق الفاصل على السطح المنعزل للوحة الزجاجية. من المهم أن يتم وضع الفاصل بشكل صحيح على لوحة القاعدة مع الزاوية العلوية اليسرى والجانبين المتجاورين للفاصل واللوحة. يتم استخدام الأسطوانة أو البراير لتسطيح الفاصل على لوحة القاعدة وإنشاء ختم محكم بينهما.
بين قوسين ، نلاحظ أن الألواح المنعزلة كاملة مع الفواصل المثقبة متوفرة تجاريا كما هو موضح في قسم المراجع. بعد إعداد لوحة قاعدة التبلور ، ننتقل بعد ذلك إلى إعداد واستخدام روبوت الميزو. كما هو مذكور فيما يلي ، نوضح استخدام ثلاثة في الروبوتات المتوسطة.
في جميع الحالات المعروضة ، يتم إعداد الروبوتات واستخدامها في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 20 درجة مئوية في روبوت الميزو الأول ، وهو أول روبوت ميسو يتم عرضه في هذا الفيديو. تم تطوير المقالة في مختبر الباحث الرئيسي وهي متاحة الآن تجاريا. يمكن العثور على التفاصيل الكاملة في قسم المراجع.
يتمعرض المواد والمعدات اللازمة لإعداد تجربة البلورة آليا هنا. وهي تشمل دفتر ملاحظات مختبري ، وميس محمل بالبروتين ، معد حديثا كما هو موضح في Jo من المادة 1 7 1 2 وموجود في حقنة هاميلتون. ألواح قاعدة محمولة مع فواصل وزجاج غطاء مطابق وزجاجة ماء وأنسجة وروبوت ميسو.
المنظر الأول هو الروبوت مع سطحه واضح. المنظر التالي هو الروبوت المكتمل بمحطة حديقة المرطب ولوحة قاعدة التبلور وكتلة الآبار العميقة التي تحتوي على محاليل ترسيب. نبدأ الإعداد بوضع لوحة القاعدة على سطح الروبوت.
لديها منصة خاصة بها ، مميزة بوضوح بمواضع جيدة لأغراض محاذاة لوحة القاعدة. يجب وضع علامة على اللوحة بوضوح لأغراض تحديد الهوية. يتم تأمين كتلة البئر 96 التي تحتوي على محاليل الترسيب في منصتها الخاصة على سطح الروبوت بجوار لوحة التبلور.
يتم فتح الكتلة عن طريق تقشير غطاء السقف البلاستيكي بعناية. يتم توجيه تيار الرطوبة من المرطب ليتدفق فوق لوحة القاعدة وعبرها على سطح الروبوت إعداد الروبوت. يتم تهيئة الروبوت باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
لننوضح ذلك بأي تفصيل هنا لأن البروتوكولات الدقيقة ستتغير بمرور الوقت. ما يحدث بشكل أساسي أثناء التهيئة هو أن ذراع توزيع الميز على الروبوت يتم تزويده بمواضع مرجعية في ثلاثة اتجاهات متعامدة ، x و Y و Z ، بعد ذلك ، يتم إرفاق مرحلة الميزا المحملة بالبروتين في حقنة هاميلتون كاملة بإبرة الاستغناء لتسليح أحد الروبوت التفاصيل الكاملة لكيفية تحضير مرحلة الميزا والحقنة موصوفة في Jo من المادة 1 7 1 2 وفي المرجع الأول ، يجب الآن محاذاة طرف الإبرة لحقنة الاستغناء مع الجزء السفلي ومركز البئر العلوي في الزاوية اليسرى من لوحة التبلور. هذا يتوافق مع معرف البئر A واحد يتماشى مع الجزء السفلي من البئر A واحد كأول ترتيب للعمل.
يتم ذلك عن طريق ضبط الارتفاع أو إحداثيات Z بعد توزيع الذراع أثناء مشاهدة مدى قرب طرف الإبرة من قاع البئر. يمكن الحكم على أن الطرف يلامس قاع البئر فقط عن طريق تحريك اللوحة يدويا من جانب إلى آخر على المنصة أثناء ضبط ارتفاع ذراع الاستغناء بشكل طفيف ، يتم برمجة إحداثيات Z لذراع الاستغناء حيث يلامس الطرف اللوحة التي يتم إدخالها في توزيع الكمبيوتر ليحدث مع طرف الإبرة عدة ميكرومترات من هذا الموضع Z المرجعي ، الذي يتوافق مع سطح لوحة القاعدة. يتم تنشيط الروبوت بعد ذلك للذهاب من خلال سلسلة من الخطوات التي يطالبها المستخدم بوضع طرف الإبرة في وسط البئر أ.
يتم تخزين إحداثيات XY المرجعية لذراع الاستغناء حيث يتم توسيط الطرف في الكمبيوتر الذي يتحكم في الروبوت. يتم استخدامه لتحديد مركز الآبار المتبقية على اللوحة. بعد تعيين هذه الإحداثيات المرجعية في الكمبيوتر ، يطلب من ذراع توزيع الميز العودة إلى موضع البداية ، وتهيئة المحقنة.
يجب الآن تحضير حقنة الاستغناء. يتم ذلك للتأكد من أن المease الطازج يملأ إبرة الاستغناء وأن البئر الأول على الطبق يتلقى مكملة كاملة من الميس. يوجد أمر أولي في البرنامج يقوم بتشغيل تنشيط الروبوت.
يتسبب في تقدم المكبس الموجود في المحقنة تدريجيا تحت سيطرة المستخدم. أثناء حدوث ذلك ، يتم فحص طرف الإبرة بحثا عن ظهور الميزة المبثوقة تتم إزالة مرحلة الميزا بمنديل. هذا يكمل عملية التحضير لتشغيل الروبوت.
الروبوت جاهز الآن للتشغيل في الوضع التلقائي لبدء التشغيل. يبدأ برنامج Robot XAP جولة من خطوات التنظيف حيث يتم غسل أطراف توزيع الترسيب على ذراع اثنين من الروبوت ويتم إعدادها لشفط المحاليل المترسبة من كتلة البئر العميقة التي تنشط وظيفة الاستغناء على الروبوت في الحركة ، والتحميل المتسلسل للآبار مع الآبار المحملة بالبروتين أول ثمانية آبار في وقت واحد ، تليها حلول مسربة بين عمليات التسليم. يعود ذراع توزيع الميز إلى وضع وقوف السيارات حيث يتم وضع نهاية الإبرة في إسفنجة مبللة لمنع الجفاف في الطرف.
الأكثر شيوعا ، القيم المستخدمة في تجارب التبلور التي يتم إجراؤها في الغشاء. مجموعة البيولوجيا الهيكلية والوظيفية هي 50 نانولترا من الميس و 800 نانولتر من المحلول المرسب. تم إعداد البرنامج الذي يقوم بتشغيل الروبوت في هذا العرض التوضيحي بحيث يتحرك الذراعين في وقت واحد.
بهذه الطريقة ، من الممكن إكمال تحميل صفيحة 96 بئر مع ميس وترسيب في خمس دقائق. على الفور تمتلئ اللوحة وعادت أذرع الروبوت إلى مواقعها في الحديقة. تتم إزالة اللوحة من سطح الروبوت وتوضع على سطح صلب مستو.
يتم وضع غطاء زجاجي برفق أعلى لوحة القاعدة عند ملامسة السطح اللاصق العلوي للفاصل. من المهم التأكد من تغطية جميع الآبار البالغ عددها 96 بئرا بالكامل ، وأن زجاج الغطاء محاذاة مربعا مع لوحة القاعدة وأن أيا من زجاج الغطاء يمتد إلى ما وراء بصمة لوحة القاعدة. يتم استخدام الأسطوانة أو المشابك لإنشاء ختم محكم وموحد بين زجاج الغطاء والفاصل.
يجب فحص اللوحة في هذه المرحلة للتأكد من أن الإعداد سار كما ينبغي. ما يبحث عنه المرء هو بيضة مقلية على مظهر المقلاة. في كل بئر ، يتوافق نير البيضة مع مرحلة الميزا.
بياض البيضة هو المحلول المرسب ، وحافة المقلاة هي محيط التبلور. حسنا ، من الناحية المثالية ، الثلاثة متحدة المركز. اللوحة جاهزة الآن لوضعها في منطقة تخزين يتم التحكم في درجة حرارتها لنمو البلورات.
إذا لم يتم إعداد المزيد من الألواح ، فيجب إزالة كتلة الترسيب من سطح الروبوت ، وإغلاقها بشكل صحيح وإعادتها إلى التخزين. تتم إزالة المحقنة التي تحتوي على الميز من ذراع الاستغناء عن الروبوت ، وتفكيك أجزائه المختلفة ، بما في ذلك الإبرة الاستغناء والفرية. يغسل بعناية بالميثانول ويجفف استعدادا للاستخدام التالي في روبوت Meso اثنين من البعوض LCP.
يظهر مقطع الفيديو التالي هذا روبوت LCP للبعوض الذي يمكن استخدامه في إعداد تجارب التبلور المتوسط. يشتمل على نظام توزيع طور meph مشابه لتلك الموصوفة سابقا في هذه المقالة. ومع ذلك ، بالنسبة للروبوت الأول ، يتم الاستغناء عن المرسب باستخدام أطراف يمكن التخلص منها.
الأداة نفسها موضحة هنا. يشتمل على سطح تضع عليه لوحة التبلور والكتلة المرسب غرفة ذات نوافذ للتحكم في الرطوبة. في هذا المنظر ، تم فتح النوافذ الموجودة في غرفة الرطوبة بكرة مع أطراف الاستغناء ، وذراع توزيع الميز ، وجهاز استشعار قائم على الليزر لتحديد موقع إبرة توزيع طور meph.
منصة مرتفعة تجلس عليها لوحة التبلور منصة غارقة لتثبيت كتلة الشاشة المترسبة. في هذا التسلسل ، رأى الروبوت يمر بسلسلة تهيئة من الإجراءات عند تشغيل الجهاز. يتم استخدام برامج البرمجة لإعداد الأداة للعمل مع ألواح بلورة معينة وكتل ترسيب ، ولتوزيع أحجام محددة من المازة والترسيب في تسلسل محدد.
يتم توفير هذه التفاصيل من قبل الشركة المصنعة ولن يتم عرضها هنا. يبدأ استخدام الروبوت لإعداد لوحة التبلور على النحو التالي ، يتم تحضير حقنة هاميلتون كاملة بإبرة ومليئة بالبروتين المحملة بالبروتين كما هو موضح أعلاه في meso robot one وفي Jo of 1 7 1 2. يتم تثبيت المحقنة في موضعها تحت ذراع الاستغناء عن الروبوت.
يتم إنشاء إحداثيات X و y للإبرة على حقنة الاستغناء باستخدام مستشعر الليزر المثبت على سطح السفينة. هذه خطوة مهمة مطلوبة لضمان توزيع الميز بدقة في وسط كل بئر على لوحة التبلور. بلمسة زر واحدة على لوحة التحكم ، يتم تحضير المحقنة لطرد المازة من طرف الإبرة.
ثم تتم إزالة الميزة المبثوقة بمنديل ورقي استعدادا لاستخدام الروبوت لتحميل الآبار قبل تركيب لوحة التبلور على سطح الروبوت. يتم ترطيب سطح المنصة ببضع قطرات من الماء لتثبيت اللوحة في مكانها. عن طريق الشعيرات الدموية ، تتم إزالة الغطاء الواقي من اللوحة ويتم وضع اللوحة على منصتها بإحكام لضمان الالتصاق الجيد.
هناك ثلاثة إمكانيات على المنصة التي تتركز عليها آبار الزاوية الثلاثة قريبا لضمان الوضع المناسب للوحة فيما يتعلق بطرف إبرة الاستغناء ، والجهاز جاهز الآن للدخول في دورة الإعداد. يبدأ هذا بخطوة تحضير ثانية حيث يتم الاستغناء عن Mease على صفيحة زجاجية صغيرة مباشرة قبل الانتقال لتحميل اللوحة بالفطرة الطازجة. في هذا التسلسل ، نرى الروبوت يحمل أولا بالعصارة ، وهو عمود عمودي من ثمانية آبار على اللوحة ، ثم يستخدم النصائح التي يمكن التخلص منها لتوزيع محلول الترسيب فوق بلعة الترسيب.
تتكرر هذه العملية 11 مرة على طول اللوحة حتى تمتلئ جميع الآبار. تستغرق العملية برمتها حوالي خمس دقائق حتى تكتمل. في هذا الفيديو بالذات ، تم توزيع 50 نانولتر من Mease و 800 نانولتر من محلول الترسيب في كل بئر.
تتم إزالة اللوحة المملوءة من منصة الروبوت الموضوعة على مقعد. يتم تطبيق زجاج الغطاء ويتم إغلاق اللوحة بحمالة صدر كما هو موضح أعلاه في ميسو روبوت واحد. يمكن الآن وضع اللوحة المصنفة بشكل صحيح في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها لنمو البلورات في روبوت Meso الثالث ، Griffin LCP.
يظهر مقطع الفيديو الأخير هذا روبوت Griffin LCP قيد الاستخدام أثناء إعداده في تجارب التبلور المتوسط. يشتمل Griffin على نظام توزيع طور meph مماثل لتلك الموصوفة أعلاه للروبوت الأول. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يتم الاستغناء عن جميع المحاليل المرسبة البالغ عددها 96 محاليل في وقت واحد.
الأداة نفسها موضحة هنا. يشتمل على سطح تجلس عليه لوحة التبلور والكتلة المرسب ، وذراع توزيع الميز ورأس طرف Phoenix 96. لتوزيع المحاليل المترسبة ، يظهر الروبوت أثناء العمل في تسلسل الفيديو النهائي هذا.
يتم تحميل رأس الطرف 96 أولا بمحلول مرسب. يتم توفير تأخير محدد من قبل المستخدم لتسهيل شفط الرواسب اللزجة. يتم توزيع مرحلة MEA بالتتابع في 96 بئرا في عملية تستغرق حوالي دقيقة واحدة لإكمالها.
أخيرا ، يوزع رأس الطرف 96 جميع المحاليل الترسيبية البالغ عددها 96 في وقت واحد فوق جرعات الطور MEA في آبار التبلور. تكتمل عملية تحميل اللوحة بأكملها في دقيقتين. تتم إزالة اللوحة المملوءة من سطح الروبوت ويتم إغلاق اللوحة بغطاء زجاجي ووضعها في التخزين تحت ظروف درجة حرارة خاضعة للرقابة لنمو البلورات.
تتمثل الخطوات التالية في العملية الشاملة للتحديد المنظم بواسطة علم البلورات الجزيئي في حصاد البلورات وتبريدها بالتبريد ، وتسجيل ومعالجة حيود الأشعة السينية منها. يتم تناول هذه الموضوعات في مقالات وظيفية منفصلة في هذه السلسلة.
النظرة العامة
تصف هذه المقالة نهجًا آليًا لبلورة البروتينات الغشائية عالية الإنتاجية في الطور الوسطي الشحمي، مما يسهل تحديد البنية عبر البلورات بالأشعة السينية للجزيئات الكبيرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء البنيوي
- الفيزياء الحيوية
- الروبوتات في البحوث
الخلفية
- بلورة البروتينات الغشائية ضرورية للدراسات البنيوية.
- طريقة الطور الوسطي أو الطور التكعيبي الشحمي هي نهج شائع.
- يمكن أن يكون توزيع الأطوار الوسطية اللزجة يدويًا تحديًا.
- يمكن أن تعزز الأنظمة الروبوتية السرعة والدقة في تجارب البلورة.
غرض الدراسة
- لإثبات استخدام الروبوتات في البلورة عالية الإنتاجية.
- لتحسين كفاءة تحديد بنية البروتين الغشائي.
- لعرض ثلاثة أنظمة روبوتية مختلفة لهذا الغرض.
الطرق المستخدمة
- تحضير لوحات البلورة بسطح سيلاني.
- إعداد الروبوتات في الطور الوسطي في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها.
- توزيع الطور الوسطي المحمل بالبروتين باستخدام الأذرع الروبوتية.
- مواءمة وبدء أنظمة توزيع الروبوتات.
النتائج الرئيسية
- تبيّن ناجحة لتقنيات البلورة الروبوتية.
- تحسين التكرار والسرعة في تجارب البلورة.
- التعامل الفعال مع الأطوار الوسطية اللزجة بواسطة الروبوتات.
- زيادة الإنتاجية في أبحاث البروتين الغشائي.
الاستنتاجات
- تحسن الأنظمة الروبوتية بشكل كبير من سير عمل البلورة.
- يمكن أن تؤدي الأتمتة إلى نتائج أفضل في علم الأحياء البنيوي.
- قد تؤدي الدراسات المستقبلية إلى تحسين هذه التقنيات الروبوتية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Robotic automation of lipidic mesophase crystallization addresses a critical bottleneck in membrane protein structure determination by enabling high-throughput, reproducible dispensing of viscous samples. This capability accelerates target validation and lead identification campaigns by improving crystallization success rates and reducing hands-on time. The approach supports predictive confidence in structural biology workflows by standardizing a traditionally low-yield, operator-dependent step.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables systematic screening of membrane protein constructs under standardized conditions to clarify structure-function relationships.
- Operational Value: Reduces variability in crystallization trials through precise, robot-controlled nanoliter dispensing of protein-laden mesophase.
- Predictive Value: Increases likelihood of obtaining diffraction-quality crystals, thereby de-risking downstream structural analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible crystallization outputs suitable for assay optimization and hit validation.
- Operational Value: Facilitates miniaturized, parallel screening of precipitant conditions across 96-well formats with minimal sample consumption.
- Assay Readiness: Produces sealed, uniform crystallization plates compatible with automated imaging and crystal growth monitoring systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports structure-guided drug design by providing reliable access to high-resolution membrane protein targets.
- Preclinical Alignment: Enables consistent production of structural data for target engagement and mechanism-of-action studies.
- Mechanistic De-risking: Reduces attrition risk in lead optimization by improving confidence in target structural models.
Pipeline & Workflow Integration
Robotic in meso crystallization fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs medicinal chemistry decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid structural characterization of membrane protein targets and variants.
- Screening: Delivers assay-ready crystallization plates with standardized mesophase and precipitant distribution for reliable hit confirmation.
- Analytics: Provides structural readouts (crystal quality, diffraction resolution) that guide protein engineering and construct selection.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through reproducible structure determination pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, shared capability for membrane protein projects across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through increased access to high-resolution structural data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput of crystallization trials via automated, precise liquid handling.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by reducing time-to-structure for challenging membrane protein targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted project prioritization by enabling earlier structural insights into target druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein biochemistry and crystallization screening design.
- Depends on access to robotic platforms capable of handling high-viscosity lipidic mesophases.
- Necessitates standardized plate preparation and sealing protocols to ensure crystallization success.
- Involves environmental controls (temperature, humidity) to maintain mesophase stability during dispensing.
- Demands training for robotic system setup, alignment, and maintenance to ensure dispensing accuracy.
