استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

مرحباً بكم في مجموعة البيولوجيا التركيبية والوظيفية للأغشية. اسمي مارتن كافري. هذا مقال آخر ضمن سلسلة مقالات JoVE حول بلورة بروتينات الغشاء للتحديد التركيبي باستخدام طريقة الطور المكعب الدهني أو in meso.

في المقال الأول، JoVE 1 7 1 2، أوضحنا كيفية تحضير الطور المكعبي المحمل بالبروتين وكيفية توزيع طور misa اللزج واللاصق يدوياً في ألواح زجاجية شطيرية لإجراء تجارب التبلور. سيصف هذا المقال المرئي طرق استخدام روبوت التبلور في الوسط (in meso). يوفر الروبوت مزايا تتمثل في السرعة، والدقة، والضبط، والتصغير، والقدرة على العمل لفترات ممتدة تحت ظروف غير مريحة مثل الظلام أو درجات الحرارة المنخفضة.

يمكن للروبوتات، عند استخدامها بشكل صحيح، أن تحسن بشكل كبير من إنتاجية الأبحاث المتعلقة ببنية ووظيفة بروتينات الغشاء. في هذا المقال المرئي، نستعرض استخدام ثلاثة روبوتات متوفرة تجارياً. وقد تم تطوير الروبوت الأول في مجموعة البيولوجيا البنيوية والوظيفية للأغشية، وهو موصوف بالتفصيل في المرجع الأول.

أما الخياران الآخران فقد أصبحا متاحين مؤخراً، وأُدرجا هنا من أجل الاكتمال. يبدأ تحضير لوحة البلورة لضبط تجربة بلورة روبوتية بتجهيز اللوحة الأساسية للوحة بلورة الساندوتش الزجاجية الموصوفة بالتفصيل في المرجع؛ حيث يجب أولاً معالجة اللوحة الأساسية بمادة السيلان، ثم تثبيت الفاصل المثقوب ذو اللاصق المزدوج الذي يشكل الآبار على اللوحة. وتظهر المواد المطلوبة لذلك هنا.

وتشمل هذه الأدوات لوحة قاعدة تبلور زجاجية، وفاصلًا مزدوج الالتصاق مثقوبًا لمحلول التبلور، وأسطوانة أو بكرة توزيع، ومناديل ورقية، وكأسًا من مياه UE. توضع اللوحة فوق منشفة ورقية على سطح طاولة المختبر. يتم وضع بضع قطرات من محلول التبلور، ثم تُوزع بالتساوي على سطح اللوحة باستخدام منديل ورقي.

تُغسل الشريحة من محلول السيلنة الزائد عن طريق غمرها بالكامل في بيكر يحتوي على الماء. تُرفع الشريحة من البيكر وتوضع على منشفة ورقية جافة، بحيث يكون الجانب المْسيلن للأعلى، ثم يُجفف سطحها المكشوف عن طريق المسح الخفيف بالمناشف الورقية.

بعد ذلك، يتم إزالة الغطاء الواقي الموجود على الفاصل ثنائي اللاصق المثقب، ثم يُوضع الفاصل على السطح المعالج بالـ siloized للصفيحة الزجاجية. ومن المهم وضع الفاصل بشكل صحيح على الصفيحة القاعدية بحيث يتطابق الركن العلوي الأيسر والجانبان المجاوران للفاصل مع الصفيحة. وتُستخدم أداة دحرجة (roller) أو بكرة (brayer) لتسوية الفاصل على الصفيحة القاعدية وإنشاء سدادة محكمة بينهما.

وبين قوسين، نلاحظ أن الأطباق المقسمة (siloized plates) المزودة بفاصلات مثقبة متوفرة تجارياً كما هو موضح في قسم المراجع. وبعد تحضير لوحة القاعدة للبلورة، ننتقل بعد ذلك إلى إعداد واستخدام روبوت الـ in meso. وكما سيتم توضيحه فيما يلي، سنستعرض استخدام ثلاثة من روبوتات الـ in meso.

في جميع الحالات المعروضة، يتم إعداد الروبوتات واستخدامها في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 20 degrees Celsius. أما meso robot one، وهو أول روبوت من نوع meso يتم عرضه في هذا الفيديو، فقد تم تطويره في مختبر الباحث الرئيسي وهو متاح الآن تجارياً. يمكن العثور على التفاصيل الكاملة في قسم المراجع.

تظهر هنا المواد والمعدات المطلوبة لإعداد تجربة بلورة آلياً. وتشمل دفتر ملاحظات مختبري، ومحاقن محملة بالبروتين، تم تحضيرها حديثاً كما هو موضح في مقال Jo رقم 1 7 1 2 وموضوعة في محقنة Hamilton. وألواح قاعدة مسيلكونة مع فواصل وزجاج تغطية مطابق، وزجاجة ماء ومناديل، وروبوت in miso.

يعرض المشهد الأول الروبوت وسطحه خالٍ. أما المشهد التالي فيعرض الروبوت كاملاً مع محطة ركن جهاز الترطيب، ولوحة قاعدة التبلور، وكتلة الآبار العميقة التي تحتوي على محلول المرسب. نبدأ عملية الإعداد بوضع لوحة القاعدة على سطح الروبوت.

يحتوي الجهاز على منصته الخاصة، والمحددة بوضوح بمواقع الآبار لأغراض محاذاة اللوحة الأساسية. ويجب وضع ملصقات واضحة على اللوحة لأغراض التعريف. كما يتم تثبيت كتلة الـ 96 بئراً التي تحتوي على محاليل الترسيب في منصتها الخاصة على سطح الروبوت بجانب لوحة البلورة.

يتم فتح القالب عن طريق نزع غطاء السقف البلاستيكي بعناية. يتم توجيه تدفق الرطوبة من جهاز الترطيب ليتدفق فوق وعبر اللوحة الأساسية الموجودة على منصة الروبوت إعداد الروبوت. يتم تشغيل الروبوت باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

لن نقوم بشرح هذا الأمر بالتفصيل هنا لأن البروتوكولات الدقيقة ستتغير بمرور الوقت. وبشكل أساسي، ما يحدث أثناء عملية التهيئة هو تزويد ذراع توزيع mease الموجود على الروبوت بمواقع مرجعية في ثلاثة اتجاهات متعامدة، x و Y و Z. بعد ذلك، يتم تثبيت طور meza المحمل بالبروتين في سرنجة Hamilton مزودة بإبرة توزيع على الذراع الأولى للروبوت؛ وقد وردت التفاصيل الكاملة حول كيفية تحضير طور meza والسرنجة في مقالة JoVE رقم 1712 وفي المرجع الأول. يجب الآن محاذاة طرف إبرة سرنجة التوزيع مع قاع ومركز البئر العلوي في الزاوية اليسرى من لوحة البلورة. وهذا يتوافق مع معرف البئر A1، بحيث تكون محاذاة القاع للبئر A1 هي الخطوة الأولى في العملية.

يتم تنفيذ ذلك من خلال ضبط الارتفاع أو الإحداثي Z لذراع التوزيع مع مراقبة مدى قرب طرف الإبرة من قاع البئر. يمكن التحقق من ملامسة الطرف لقاع البئر تماماً عن طريق تحريك اللوحة يدوياً من جانب إلى آخر على المنصة مع ضبط ارتفاع ذراع التوزيع بشكل طفيف للغاية، ثم يتم إدخال الإحداثي Z لذراع التوزيع عند نقطة تلامس الطرف مع اللوحة في الكمبيوتر؛ حيث يتم برمجة عملية التوزيع لتتم بينما يكون طرف الإبرة على بُعد عدة ميكرومترات من موضع Z المرجعي هذا، والذي يتوافق مع سطح اللوحة القاعدية. بعد ذلك، يتم تفعيل الروبوت للمرور بسلسلة من الخطوات التي يطلبها المستخدم لوضع طرف الإبرة في مركز البئر A1.

يتم تخزين إحداثيات XY المرجعية لذراع التوزيع حيث تكون رأس الماصة متمركزة في الكمبيوتر الذي يتحكم في الروبوت. وتُستخدم هذه الإحداثيات لتحديد مركز الآبار المتبقية في الطبق. وبعد ضبط هذه الإحداثيات المرجعية في الكمبيوتر، يتم توجيه ذراع توزيع mease للعودة إلى موضع البدء، مما يؤدي إلى تحضير المحقنة.

يجب الآن تحضير سرنجة التوزيع. يتم ذلك لضمان ملء إبرة التوزيع بمادة mease الطازجة، ولضمان حصول البئر الأول في اللوح على كامل الكمية المخصصة له من mease. يوجد أمر تحضير في البرنامج الذي يشغل الروبوت لتفعيل هذه العملية.

يؤدي ذلك إلى دفع المكبس في المحقنة للأمام بشكل تدريجي تحت تحكم المستخدم. وأثناء حدوث ذلك، يتم فحص طرف الإبرة للتأكد من ظهور فقاعات الهواء، حيث يتم إزالة أي طور مائي ظاهر باستخدام منديل ورقي. وبذلك تكتمل عملية التجهيز لتشغيل الروبوت.

أصبح الروبوت الآن جاهزاً للعمل في الوضع التلقائي لبدء التشغيل. يبدأ برنامج Robot XAP جولة من خطوات الشطف حيث يتم غسل رؤوس توزيع الرواسب الموجودة على الذراع الثانية للروبوت وتجهيزها لسحب محاليل الرواسب من كتلة الآبار العميقة؛ ويؤدي تفعيل وظيفة التوزيع في الروبوت إلى بدء التحميل المتسلسل للآبار بالعينات البروتينية، ثمانية آبار في المرة الواحدة، تليها محاليل الرواسب بين عمليات التوزيع. وتعود ذراع توزيع العينات إلى موضع التوقف حيث يوضع طرف الإبرة في إسفنجة مبللة لمنع جفاف العينة عند الطرف.

في أغلب الأحيان، تكون القيم المستخدمة في تجارب البلورة التي تجريها مجموعة البيولوجيا التركيبية والوظيفية هي 50 nanoliters من المحلول والـ 800 nanoliters من محلول الترسيب. وقد تم إعداد البرنامج الذي يشغل الروبوت في هذا العرض التوضيحي بحيث تتحرك الذراعان في وقت واحد.

بهذه الطريقة، يمكن إكمال تحميل لوحة ذات 96 بئراً بالمحلول المراد قياسه والمادة المرسبة في غضون خمس دقائق. وبمجرد ملء اللوحة وعودة أذرع الروبوت إلى مواضع التوقف الخاصة بها، تُزال اللوحة من منصة الروبوت وتوضع على سطح صلب ومستوٍ.

توضع شريحة غطاء الزجاج برفق فوق اللوحة القاعدية بحيث تلامس السطح اللاصق العلوي للفاصل. ومن المهم التأكد من تغطية جميع الآبار الـ 96 بالكامل، وأن تكون شريحة غطاء الزجاج محاذية بشكل مربع مع اللوحة القاعدية، وألا يمتد أي جزء من شريحة غطاء الزجاج خارج حدود اللوحة القاعدية. تُستخدم أسطوانة أو بكرة (brayer) لإنشاء ختم محكم وموحد بين شريحة غطاء الزجاج والفاصل.

يجب فحص الطبق في هذه المرحلة للتأكد من أن عملية الإعداد تمت كما ينبغي. والمطلوب هو البحث عن مظهر يشبه بيضة مقلية في مقلاة؛ حيث يمثل صفار البيضة في كل بئر طور الميزا (meza phase).

يُعد بياض البيض هو محلول الترسيب، وتمثل حافة المقلاة محيط التبلور. ومن الناحية المثالية، تكون هذه العناصر الثلاثة متحدة المركز. والآن أصبحت الشريحة جاهزة لوضعها في منطقة تخزين ذات درجة حرارة مضبوطة لنمو البلورات.

إذا لم تكن هناك حاجة لتجهيز المزيد من الأطباق، فيجب إزالة كتلة المُرسب من سطح الروبوت، وإغلاقها بإحكام، ثم إعادتها إلى مكان التخزين. تُزال السرنجة التي تحتوي على الوسط من ذراع التوزيع في الروبوت، وتُفكك أجزاؤها المختلفة، بما في ذلك إبرة التوزيع والوصلة (ferrule). تُغسل هذه الأجزاء بعناية باستخدام الميثانول وتُجفف استعداداً للاستخدام التالي في روبوت Meso لبلورات البروتين بطريقة الطور السائل (LCP).

يوضح مقطع الفيديو التالي روبوت mosquito LCP الذي يمكن استخدامه في إعداد تجارب التبلور في الوسط الميزوفازي (in meso). وهو يشتمل على نظام توزيع لمرحلة الميزوفازي مشابه للنظام الموصوف سابقاً في هذا المقال. ومع ذلك، في الروبوت الأول، يتم توزيع المادة المرسبة باستخدام رؤوس ماصات مخصصة للاستخدام لمرة واحدة.

يظهر الجهاز هنا. وهو يتضمن منصة يتم عليها وضع لوحة التبلور وكتلة المرسب، وغرفة بنوافذ للتحكم في الرطوبة. وفي هذا المنظر، تم فتح النوافذ الموجودة في غرفة الرطوبة، ويظهر بكرة تحتوي على رؤوس توزيع، وذراع توزيع للقياس، ومستشعر يعتمد على الليزر لتحديد موقع إبرة توزيع طور meph.

منصة مرتفعة تستقر عليها لوحة التبلور، ومنصة غائرة لحمل كتلة فحص المرسب. في هذا التسلسل، يكون الروبوت قد أتم سلسلة من إجراءات التهيئة عند تشغيل الجهاز. يُستخدم برنامج البرمجة لتهيئة الجهاز للعمل مع لوحات تبلور وكتل مرسبات محددة، ولتوزيع أحجام محددة من العينة والمرسب وفق تسلسل معين.

يوفر المصنع مثل هذه التفاصيل ولن يتم عرضها هنا. يبدأ إعداد لوحة التبلور باستخدام الروبوت على النحو التالي: يتم تحضير حقنة Hamilton كاملة مع الإبرة ومملوءة بمحلول البروتين كما هو موضح أعلاه في قسم "روبوت in meso" وفي JoVE 1 7 1 2. يتم تثبيت الحقنة في موضعها أسفل ذراع التوزيع الخاص بالروبوت.

يتم تحديد إحداثيات X وy للإبرة الموجودة في سرنجة التوزيع باستخدام مستشعر الليزر المثبت على المنصة. وتعد هذه خطوة مهمة ومطلوبة لضمان توزيع mease بدقة في مركز كل بئر في لوحة البلورة. وبضغطة زر على لوحة التحكم، يتم تجهيز السرنجة لطرد mease من طرف الإبرة.

يتم بعد ذلك إزالة المادة الزائدة باستخدام منديل ورقي تحضيراً لاستخدام الروبوت في ملء الآبار قبل تثبيت لوحة البلورة على منصة الروبوت. يتم ترطيب سطح المنصة ببضع قطرات من الماء لتثبيت اللوحة في مكانها. وبواسطة الخاصية الشعرية، يتم إزالة الغطاء الواقي من اللوحة، ثم توضع اللوحة على منصتها بإحكام لضمان الالتصاق الجيد.

توجد ثلاث علامات مرجعية على المنصة تتركز فوقها آبار الزوايا الثلاث لضمان وضع الصفيحة بشكل صحيح بالنسبة لطرف إبرة التوزيع، والجهاز الآن جاهز لبدء دورة الإعداد. يبدأ ذلك بخطوة تحضير ثانية حيث يتم توزيع Mease على صفيحة زجاجية صغيرة مباشرة قبل الانتقال إلى تحميل الصفيحة بـ mease طازج. في هذا التسلسل، نرى الروبوت يقوم أولاً بتحميل عمود رأسي مكون من ثمانية آبار على الصفيحة بـ mease، ثم يستخدم الرؤوس التي تستخدم لمرة واحدة لتوزيع محلول الترسيب فوق كتلة mease.

تُكرر هذه العملية 11 مرة على طول الطبق حتى يتم ملء جميع الآبار. وتستغرق العملية بأكملها حوالي خمس دقائق لإتمامها. في هذا الفيديو تحديداً، تم توزيع 50 nanoliters من Mease و800 nanoliters من محلول الترسيب في كل بئر.

يتم إخراج اللوحة المملوءة من منصة الروبوت الموضوع على طاولة المختبر. يتم وضع الغطاء الزجاجي وإحكام غلق اللوحة باستخدام شريط لاصق كما هو موضح أعلاه في Meso robot one. يمكن الآن وضع اللوحة المصنفة بشكل صحيح في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها لنمو البلورات في Meso robot three، وهو جهاز Griffin LCP.

يظهر مقطع الفيديو النهائي هذا روبوت Griffin LCP أثناء استخدامه في إعداد تجارب التبلور في الوسط (in meso). يشتمل Griffin على نظام توزيع طور الميزوفيز (meph phase) مشابه للنظام الموصوف أعلاه للروبوت الأول. ومع ذلك، في هذه الحالة، يتم توزيع جميع محاليل المرسبات الـ 96 في وقت واحد.

يظهر الجهاز نفسه هنا. وهو يتضمن منصة توضع عليها لوحة التبلور وكتلة المرسب، وذراع توزيع القياس، ورأس رؤوس ماصات Phoenix 96. ولتوزيع محاليل المرسب، يظهر الروبوت أثناء العمل في هذا التسلسل المرئي النهائي.

يتم تحميل رأس الماصات المكون من 96 طرفًا أولاً بمحلول المرسب. يتم توفير فترة تأخير يحددها المستخدم لتسهيل سحب المرسبات عالية اللزوجة. يتم توزيع طور MEA بالتتابع في الـ 96 بئرًا في عملية تستغرق حوالي دقيقة واحدة لإتمامها.

وأخيرًا، يقوم رأس الماصات ذو الـ 96 طرفًا بتوزيع جميع محاليل الترسيب الـ 96 في وقت واحد فوق كتل طور MEA في آبار التبلور. تكتمل عملية تحميل اللوحة بأكملها في غضون دقيقتين. ثم تُنزع اللوحة المملوءة من سطح الروبوت، وتُغلق بإحكام باستخدام غطاء زجاجي، وتوضع في التخزين تحت ظروف درجة حرارة مضبوطة لنمو البلورات.

تتمثل الخطوات التالية في العملية العامة لتحديد البنية بواسطة علم البلورات الجزيئية الكبيرة في حصاد البلورات وتبريدها بالتجميد، ثم تسجيل ومعالجة حيود الأشعة السينية الناتجة عنها. وتتم تغطية هذه المواضيع في مقالات عمل منفصلة ضمن هذه السلسلة.I.