الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار في الموقع التهجين (FISH)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور موقع الحمض النووي الريبي الفيروسي في C اثنين داخل الخلايا. لتحقيق ذلك أولا ، قم بزراعة الخلايا التي سيتم نقلها أو إصابتها على زلات الغطاء الزجاجي. الخطوة الثانية هي إصلاح الخلايا بنسبة 4٪ ألدهيد باراتيكل بعد التعدي أو العدوى الناجحة.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا بخليط تهجين يضع علامة على الحمض النووي الريبي. يتم ذلك عن طريق وضع جانب خلية انزلاق الغطاء لأسفل على خليط التهجين على شريحة. الخطوة الأخيرة في هذا الإجراء هي استخدام الأجسام المضادة لتلطيخ الخلايا لملصق الحمض النووي الريبي.

في النهاية ، يتم تصور توطين الحمض النووي الريبي المسمى داخل الخلية عن طريق التألق في C اثنين من التهجين أو السمكة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل تصوير الحمض النووي الريبي وخلايا الحياة باستخدام العلامات هي أنه يمكن اكتشاف الحمض النووي الريبي الأصلي بدلا من الحمض النووي الريبي المعدل. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنها تتطلب مرضى في الرعاية والتعامل مع قسائم التغطية ، وتوحيد الطريقة ، بالإضافة إلى التوقيت الدقيق.

أثناء الحضانات ، يعتمد الإجراء المحدد لزراعة الخلايا للتثبيت على نوع الخلايا. بالنسبة للخلايا الملتصقة ، من المهم في البداية زرعها على زلات غطاء زجاجية معقمة غير معالجة. لذا فإن الطلاقة النهائية عند الحصاد هي حوالي 70 إلى 80٪ يجب زراعة الخلايا غير الملتصقة بالطريقة القياسية حتى تصبح جاهزة للجمع.

ثم احتضنها بزلات الغطاء التي تمت معالجتها باستخدام بولي إل ليسين للوحة زراعة أنسجة البوليسترين النموذجية المكونة من 12 جيدا 150،000 خلية لكل بئر في 24 ساعة قبل الإصابة أو التعدين. احتضان الخلايا على شفاه الغطاء لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لبدء إجراء تثبيت الخلايا. تخلص من الوسائط عن طريق الشفط الدقيق وأضف برفق واحدة من XPBS المحضر والماء المقطر المزدوج.

أو تغسل DPBS الخلايا لمدة دقيقة واحدة. يمكن أيضا استخدام Dathyl pyro CARBATE أو DEPC معالج بواحد XPBS. لا تستخدم PBS غير المعالج لأنه قد يحتوي على إنزيمات R nase.

تخلص من DPBS وأضف برفق ما يكفي. 4٪ para formaldehyde لتغطية الخلايا تحتضن تماما لمدة 15 إلى 20 دقيقة بعد ذلك ، تخلص من البارالديهايد واغسل الخلايا باستخدام DPBS لمدة دقيقة واحدة. تخلص من DPBS وأضف 0.1 مولار جلايسين يحتضن لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، تخلص من الجلايسين واغسل الخلايا باستخدام DPBS لمدة دقيقة واحدة. بعد التخلص من DPBS ، أضف 0.2٪ Triton X 100 ، واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق. إذا كان تلطيخ بروتينات الغلاف النووي أو النووي تتخلل مع triton X 100 لمدة لا تزيد عن خمس دقائق أو سيصبح توطين البروتين منتشرا.

تخلص من triton X 100 واغسلها مرتين في DPBS لمدة دقيقة واحدة في كل مرة قبل بدء إجراء الأسماك. قم بإعداد الجوانب التي تحتضن عليها زلات الغطاء مع الحرص على تنظيفها وتسميتها جيدا. للحصول على زلة غطاء 18 ملم ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الحمض النووي إلى الشريحة.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو التعامل السليم مع زلات الغطاء. من المهم التأكد من احتضان الجانب الأيمن من زلة الغطاء والتعامل معها برفق. لتجنب الكسر ، أضف زلة الغطاء إلى الشريحة ، وتأكد من وضعها على جانب الخلية لأسفل واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد 15 دقيقة ، ضع جانب بيع الغطاء لأعلى في طبق استزراع مع X-D-P-B-S.

اغسل زلات الغطاء لمدة دقيقة واحدة. يحتوي هذا المزيج على ما يلي. 50٪ من شكل أميد منزوع الأيونات ملليغرام واحد لكل مليلتر ، TRNA اثنين من X-S-S-P-E خمسة X dnar RNAs خارج المسبار وماء DEPC إلى الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولترا.

المسبار عبارة عن مسبار RNA يسمى جينين حفر مصمم ليكون مكملا للحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي. مكان. كل غطاء ينزلق جانب الخلية لأسفل على خليط التهجين على الشريحة. يجب إجراء الحضانة في صينية تحتوي على 50٪ FIDE اثنين من X-S-S-P-E.

اخلطي الحضانة لمدة 16 إلى 18 ساعة عند 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، احتضن جانب خلية انزلاق الغطاء لأسفل في 50 ميكرولتر من 50٪ fide لمدة 50 دقيقة عند 42 درجة مئوية. اغسل زلات الغطاء مرتين في اثنين من X-S-S-P-E عن طريق احتضان الجانب لأسفل في 50 ميكرولترا من اثنين من X-S-S-P-E لمدة خمس دقائق لكل منهما عند 42 درجة مئوية.

أخيرا ، اغسل زلات الغطاء في X-D-P-P-S لمدة دقيقة واحدة. لبدء هذا الإجراء ، قم بسد زلات الغطاء عن طريق وضع جانب الخلية لأسفل في 50 ميكرولترا من محلول حجب X Roche لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة عند اكتمال الحجب ، ضع كل جانب خلية منزلقة للغطاء لأسفل في 50 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الأساسي الذي يحتوي على جميع الأجسام المضادة الأولية للتجربة بتركيزاتها المناسبة. احتضن لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية بعد ساعة.

ضع جانب خلية الغطاء المنزلق لأعلى في طبق مزرعة يحتوي على DPPS واغسل زلات الغطاء لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الثانوية على شريحة لكل زلة غطاء. يمكن استخدام الأجسام المضادة المترافقة الأرضية من Alexa لتوليد مجموعة من الألوان وتستخدم في تخفيف واحد إلى 500 في محلول حجب X واحد و X-D-P-B-S ضع كل جانب خلية زلة غطاء لأسفل في محلول الجسم المضاد الثانوي واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة.

اغسل الغطاء مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما. في DPBS ، ينزلق الغطاء جانب الخلية لأعلى على قطعة من ورق النشاف. تأكد من تغطية زلات الغطاء لتجنب التعرض للضوء والتبييض.

بمجرد أن يتبخر السائل بالكامل ، قم بتركيب الغطاء على شرائح جديدة. باستخدام ثمانية ميكرولترات من الحامل المناعي ، اضغط برفق على زلة الغطاء للتخلص من أي فقاعات هواء ، ضع طلاء الأظافر على حواف زلة الغطاء لتثبيته في مكانه. يعد تصور الحمض النووي الريبي والبروتينات بواسطة تقنيات الفحص المجهري أمرا بالغ الأهمية أيضا لنجاح هذا الإجراء.

يمكن أن تساعد الإعدادات الموجودة على المجهر المستخدم في التصور أو تعيقه. لذلك ، من المهم ضبط الإعدادات على المجهر بشكل صحيح وأن تكون متسقة من عينة إلى أخرى في تجربة معينة. يوضح هذا الشكل نتيجة تمثيلية لتصور الحمض النووي الريبي الفيروسي عن طريق الأسماك وتوطين البروتين عن طريق التألق المناعي.

في هذه اللوحة الأولى حيث يتم نقل خلايا هيلا مع فيروس نقص المناعة البشرية الأول ، يظهر الحمض النووي الريبي الفيروسي لفيروس نقص المناعة البشرية الذي يحمل باللون الأخضر في جميع أنحاء السيتوبلازم المعروض بشكل منتشر في الغالب ، على الرغم من أن البونت السيتوبلازمي الصغير ليس من غير المألوف ، يمكن رؤية الخصوصية من خلال مقارنة الخلايا الموجبة بالخلايا المحيطة التي لا تظهر أي مضان كما هو موضح في الصورة الداخلية بالأبيض والأسود التي تمثل تلطيخ الحمض النووي الريبي الفيروسي فقط. تعكس البقعة الحمراء التألق المناعي لبروتين Ross GA PSH ثلاثي المجالات أو G ثلاثة نقاط أساس ، والذي يميز السيتوبلازم بشكل أساسي عندما يتم نقل خلايا الهليكوبلازم بفيروس نقص المناعة البشرية الذي يفتقر إلى بروتين المراجعة التنظيمي. يتم الاحتفاظ بالحمض النووي الريبي الفيروسي المنتج في النواة.

يمكن تصور ذلك على أنه إشارة خضراء زاهية في النواة ونقص إشارة فلورسنت الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم. التوزيع من ال [هيف] واحدة [رنا] فيروسية يستطيع أيضا كنت غيرت ب [فرفرأيشنس] من بروتينات خلوية مؤكدة. على سبيل المثال ، يؤدي الإفراط في التعبير عن RAB سبعة بروتين ليزوزومي متفاعل أو حقيقي ، وهو بروتين يشارك في تهريب الحويصلة الداخلية إلى إعادة توطين الحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي الذي يتم تتبعه باللون الأخضر إلى مركز تنظيم الأنبوب الدقيق.

هنا يتم تمييز الجسيمات الداخلية بواسطة المصباح الأول وملطخة باللون الأحمر. في المقابل ، فإن الإفراط في التعبير عن دلتا N المحذوف نهائيا والذي لا يستطيع الارتباط ب P واحد 50 الملصق من مركب محرك الدين يشتت الجسيمات الداخلية المتأخرة داخل السيتوبلازم على التعبير عن P 50 dyin يمنع الوحدة الفرعية الكبيرة لمحرك الدين ويطلق الجسيمات الداخلية المتأخرة ، ولكن أيضا الحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي و HIV V البروتينات الهيكلية إلى محيط الخلية. عندما يتم التعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية في خلايا الهليكوبتر ثم يتم جمع الخلايا وتحليلها في نقاط زمنية مختلفة ، يظهر الحمض النووي الريبي الفيروسي في الخلية في وقت مبكر يصل إلى ثلاث ساعات بعد التعدي والعدوى ويصبح قابلا للملاحظة بسهولة بواسطة تقنية الأسماك هذه بمقدار 12 ساعة.

هنا يتم تتبع تعبير الحمض النووي الريبي الفيروسي باللون الأخضر بينما يتم تلطيخ البروتين الخلوي H-N-R-N-P-A باللون الأحمر بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 20 دقيقة في اليوم الأول وأربع ساعات ونصف في اليوم الثاني إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع زلات الغطاء بدقة لتجنب كسرها والتأكد من تجنب الضوء بمجرد تطبيق الجسم المضاد الثانوي. لا تنس عند العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية V واحد وأي مسببات الأمراض الأخرى ذات المستوى الأعلى ، فهي خطيرة للغاية قبل التثبيت ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التدريب الكافي والاحتواء أثناء تنفيذ هذا الإجراء.