الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي في الموقع التهجين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعيين مجسات الحمض النووي إلى كروموسومات بوليتان البعوض باستخدام تحضير كروموسوم عالي الضغط ، متبوعا بالفلورسنت الآلي في C Two التهجين والتصوير الآلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير فروق كروموسوم البوليتان أولا باستخدام طريقة الضغط العالي. تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في إعداد مجسات الفلورسنت عن طريق تسمية الحمض النووي الخلفي الجيني باستخدام الفلوروكروم باستخدام بروتوكول ترجمة.

الخطوة الثالثة هي إجراء الفلورسنت في C Two التهجين باستخدام أنظمة تلطيخ الشرائح الآلية. الخطوة الأخيرة هي مسح وتصوير الكروموسومات المصنفة باستخدام نظام تصوير الفلورسنت التلقائي. في النهاية ، يمكن أن تظهر الصور توطين مسبار الحمض النووي المسمى بالفلورسنت على الكروموسوم المتعدد

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الطرق الحالية ، مثل بروتوكول التهجين اليدوي القياسي في الموقع ، في أن بروتوكول رسم الخرائط المادي الأعلى إنتاجية ينتج نتائج أكثر اتساقا ويقلل بشكل كبير من وقت التدريب العملي. يبدأ هذا البروتوكول بتشريح نصف الجاذبية والإناث في حوالي 25 ساعة بعد إطعام الدم لجمع المبايض عندما يكونون في مرحلة كريستوفر الثالثة. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون للمنطقة الشفافة التي تحتوي على خلايا ممرضة داخل البصيلات شكل دائري ، وجمع المبايض من خمس إناث وإصلاحها في 500 ميكرولتر من محلول ضوضاء السيارة المعدل حديثا.

يمكن بعد ذلك تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة أو لفترة أطول عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قبل عمل شرائح تشريح المبيض مباشرة ، قم بإعداد محلول ضوضاء السيارة وحمض البروبيونيك بنسبة 50٪. ضع كل زوج من المبايض في قطرة من محلول ضوضاء السيارة الطازج على شريحة خالية من الغبار تحت مجهر التشريح.

تقسيم المبايض بإبرة التشريح. انقل جميع قطع المبيض إلى ست شرائح نظيفة مع 50٪ حمض البروبيونيك. افصل البصيلات عن بعضها البعض باستخدام إبر التشريح.

ثم امسح أي مناديل متبقية بمنشفة ورقية. أضف قطرة أخرى من حمض البروبونيك بنسبة 50٪ وانتظر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. الأسطورة ، تجلس البصيلات في 50٪ حمض البروبونيك لمدة ثلاث إلى خمس دقائق يحسن بشكل كبير انتشار الكروموسوم.

بعد ذلك ، ضع زلة غطاء وانتظر دقيقة أخرى لنشر النوى. لف الشريحة بورق الترشيح والبلاستيك. اضبط Dremel بين ثلاثة و 5 ، 000 دورة في الدقيقة ، ولمدة دقيقة واحدة تقريبا ، قم بتدوير طرف درميل دوار برفق على زلة الغطاء.

تأكد من جودة الانتشار باستخدام مجهر طوري وقم بتطبيق الدرميل لفترة أطول إذا لزم الأمر ، لتسطيح الكروموسومات. ضع زلة غطاء ثانية بجوار الأولى ، ثم ضع زلات الغطاء بمجهر آخر. قم بالتمرير بعد ذلك ، ولف الشرائح بورقة بلاستيكية وورق ترشيح ، ضع شرائح الالتفاف في نائب للضغط على الشرائح إلى ما بين 85 و 120 بوصة رطلا.

بعد تسطيح الكروموسومات على جميع الشرائح الست ، قم بفك الشرائح وإزالة الشرائح الإضافية لزيادة تسطيح الكروموسومات. احتضان الشرائح عند 55 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة في نظام تهجين تمسخ الشرائح. بعد ذلك ، اغمس شريحة في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية على الأقل أو حتى تتوقف الفقاعات.

ثم قم بإزالة زلة الغطاء بسرعة بشفرة حلاقة وضع الشريحة على الفور في البرد ، 50٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق. كرر هذه العملية لكل شريحة بالتسلسل. تجفيف الشرائح في حمام 70٪ و 90٪ و 100٪.

اغمرهم في كل حمام لمدة خمس دقائق. أخيرا ، بعد أن تجف الشرائح في الهواء ، تكون جاهزة للأسماك للتلطيخ. يقوم الجهاز الآلي بتنفيذ معظم الخطوات في الإجراء باستثناء وضع العلامات على المسبار.

لذا قبل تحميل الجهاز ، قم بإعداد مسبار الفلورسنت عن طريق وضع العلامات على الحمض النووي مرة أخرى باستخدام الفلوروكروم باستخدام بروتوكول ترجمة NIC تجاري مع إعداد المسبار ، وقم بتحميل الشرائح والكواشف في الشرائح الآلية. نظام تلطيخ وبرمجة النظام لتنفيذ الخطوات التالية. أولا ، قم بتوريد 800 ميكرولتر من XPBS واحد لمدة 20 دقيقة.

ثانيا ، جفف الشرائح. ثالثا ، قم بإصلاح الشرائح ب 450 ميكرولتر من 4٪ فورمالين في XPBS واحد لمدة دقيقة واحدة. ثم اغسل الشرائح بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة ثانية واحدة ومرتين ولمدة دقيقتين.

مرة واحدة بعد حمام الإيثانول ، جفف الشرائح مرة أخرى. الآن قم بتسخين الشرائح على حرارة 45 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتجنب الفقاعات. ثم ضع 20 ميكرولترا من مسبار الحمض النووي ، متبوعا بقطرة من الزيت المعدني وزلة غطاء في الطبيعة ، الكروموسومات عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم اضبط الشرائح على التهجين عند 42 درجة مئوية لمدة 14 ساعة. بعد التهجين ، اضبط الغسيل الصارم لمدة دقيقتين عند 42 درجة مئوية ، تليها أربعة تطبيقات متتالية لمدة ثانية واحدة لاثنين من XSSC والتجفيف. ثم ضع 800 ميكرولتر من 0.4 XSSC عند 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مرتين ، متبوعا بغسلة أخرى واثنين من XSSC عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

الآن ضع البقعة 50 ميكرولترا من اليويو متبوعا بالزيت المعدني وزلات الغطاء. احتضن الشرائح عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة زلات الغطاء.

اغسل الشرائح في قطعتين من XSSC أربع مرات لمدة ثانية واحدة لكل غسلة وجفف الشرائح. أخيرا ، ضع 15 ميكرولترا من كاشف الذهب المطول المضاد للبهتان على كل شريحة وقم بإرفاق زلات غطاء جديدة. قم بتشغيل نظام المسح الآلي Accord plus ، بدءا من مصدر طاقة Olympus U-R-F-L-T لمصباح الهالوجين.

ثم الكمبيوتر ، وأخيرا المجهر مع مرفق الكاميرا. افتح الآن حزمة برامج الثنائي أولا ، وقم بإعداد مسح مسبق 10 ×. انقر فوق الزر عبر الإنترنت ، وأدخل معرف حالة جديدا وقم بتعيين معرف شريحة.

انقر فوق النقطة المسماة bf. هذا هو خيار brightfield. حدد خيار المسح الضوئي إلى 10 × المسح المسبق.

حدد 2 ، 500 × دائرة ، 10 ، 000 × دائرة أو مستطيل. انقر فوق تعيين وتشغيل. وبعد ذلك ، حسنا ، اتبع التعليمات لضبط المسح الضوئي بشكل صحيح ثم انقر فوق إنهاء.

لبدء الفحص ، اضغط على علامة التبويب الرئيسية للعودة إلى الشاشة الرئيسية. انقر الآن على زر عدم الاتصال ، وابحث عن معرف الحالة ومعرف الشريحة الذي تم تعيينه. وانقر دون اتصال.

امسح ضوئيا في المربع الأسود في المنطقة العلوية اليسرى. انقر فوق سهم وحدد 10 × المسح المسبق. استخدم الأسهم لتصفح الصور الممسوحة ضوئيا بعد العثور على صورة تهمك.

انقر نقرا مزدوجا على الشاشة في منتصف المنطقة المستهدفة واضغط على الانقطاع. سيستهدف هذا صورة ليتم التقاطها لاحقا بعد تحديد جميع الأهداف. انقر بزر الماوس الأيمن فوق كل صورة ، وانقر فوق تصنيف وحدد 10 × المسح المسبق وحدد polytan.

ارجع إلى القائمة الرئيسية وقم بإعداد المسح المسبق 40 ×. حدد عبر الإنترنت مرة أخرى وحدد شريحة. قم بتغيير BF إلى ffl وقم بتغيير اسم المهمة لإعادة النظر في dash X 40 dash rg.

قم بتغيير القسم أسفل الإعداد الأخير مباشرة لإعادة النظر في شرطة الكل. ثم قم بتشغيل البرنامج واتبع التعليمات. لإعداد التنفيذ التلقائي، انقر فوق الزر بدء مطابقة طرق العرض لمطابقة 10 × و 40 × صور.

انقر فوق إنهاء لبدء الفحص. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق تصنيف وانظر إلى الصور. تم إجراء مستحضرات كروموسومات البوليتان لخلايا الممرضة الممرضة من شذوذ غامبيا الأنثوي باستخدام تقنية الضغط العالي.

هذه الطريقة لا تلحق الضرر أو تغير معظم بنية الكروموسوم. إنه يسطح الكروموسومات المنحنية وبالتالي يكشف عن شرائط دقيقة مخفية لا ترى في المستحضرات المنتظمة. تم فحص الكروموسوم باستخدام استنساخ الحمض النووي الخلفي الذي تم الحصول عليه من مكتبة S Gambia و Tam الخلفية الشاذة.

تم إنشاء المكتبة من الذكور والإناث أولا في يرقة النجوم من سلالة الآفات الشاذة S Gambia. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء رسم خرائط فيزيائية آلية عالية الإنتاجية من أجل تسهيل التطور السريع لتجميعات الجينوم القائمة على الكروموسوم.