تحليل كمي لياقة سير العمل

الهدف من هذا الإجراء هو التقاط اللياقات البدنية الكمية للثقافة الميكروبية بالتوازي على نطاق واسع للجينوم بطريقة دقيقة وعالية الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك من خلال مكتبة تورينج ومصفوفة الأولى من المستعمرات الميكروبية في 96 لوحة بئر وتنمية الثقافة إلى التشبع. بعد ذلك ، يتم تخفيف الثقافات المشبعة في الماء ثم رصدها على ألواح أجار صلبة.

ثم يتم تصوير صفائح الصلبة a garf بشكل دوري وحتى يتم تشبع نمو المستعمرة الميكروبية. أخيرا ، يتم تحويل صور الدورة الزمنية لنمو كل ثقافة إلى مقاييس كمية لكثافة الخلايا ويتم تلخيص منحنيات النمو المرصودة مع نماذج النمو والمقاييس الكمية للياقة الميكروبية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر دليلا على التفاعلات الجينية من خلال إثبات أن السلالات الميكروبية لها لياقات مختلفة إما عند دمجها مع طفرات مختلفة أو تنمو في ظل ظروف مختلفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل طرق التثبيت عالية الكثافة مثل SGA أو تجارب منافسة الباركود ، هي أن قياسات اللياقة البدنية أكثر دقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطوير أدوية السرطان ، مثل الجينات والعمليات المهمة في الاستجابة لتلف الحمض النووي والتحكم في دورة الخلية ، وفهم وترجمة مثل هذه الأبحاث والكائنات الحية الدقيقة الأساسية في شكل أهداف دوائية محتملة في الخلايا السرطانية البشرية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة التيلومير والمرئية.

يمكن أيضا تطبيقه على مجالات أخرى من بيولوجيا الخميرة أو في الواقع أي مجال يمكن أن توفر فيه الأنماط الظاهرية للياقة البدنية نظرة ثاقبة على البيولوجيا الميكروبية. نأمل أن يتم تطبيق QFA على العديد من الكائنات الميكروبية الأخرى التي توجد لها مكتبات مصفوفات. على سبيل المثال ، povi e coli ، فائض الأوريلا بدءا من الثقافات المشبعة بين عشية وضحاها لعبت ما يصل إلى 96 سلالة خميرة مستقلة في 200 ميكرولتر من الوسط السائل الغني.

في طبق 96 مزروع جيدا ، قم بتعقيم طبق طبق الأصل يدوي 96 دبوسا ، قطره ثمن بوصة عن طريق غمسها أولا في 100٪ من الإيثانول ، ثم إشعالها وتركه لتبرد ، 200 ميكرولتر من الماء المعقم في آبار دوامة لوحة 96 بئر تشبع مزارع الخميرة وتخفيفها عن طريق غمس أداة الدبوس المعقمة في السلالات ثلاث مرات. ثم بمجرد دخولك إلى الطبق الذي يحتوي على الماء ، قم بتعقيم أداة الدبوس ، واتركها لتبرد قبل غمسها ثلاث مرات في الثقافات المخففة. ثم انقل النصف إلى لوحة أجار صلبة.

بعد احتضان لوحات الأجار ، استخدم جهاز تصوير s و p robotics SP لتصويرها يدويا للزراعة الآلية. ابدأ بمجموعة مستطيلة من سلالات الخميرة المستقلة المزروعة على أجار صلب. في هذا المثال ، تكون سلالات البداية نتيجة عبور طفرة استعلام حساسة لدرجة الحرارة مع مجموعة حذف الخميرة.

1 ، 536 ثقافة تمثل أربعة مكررات من 384 سلالة خميرة مستقلة تزرع على ألواح SGA باستخدام روبوت بقطر 96 دبوس ، دبوس واحد بقطر ملم واحد ، نقل أداة الدبوس المعقمة 384 من 1 ، 536 سلالة إلى 4 96. تعمل ألواح زراعة الآبار التي تحتوي على 200 ميكرولتر من الوسط الانتقائي على نمو المزارع عند 20 درجة مئوية إلى التشبع. لاكتشاف مزارع الخميرة المشبعة ، ابدأ بنقلها إلى روبوت لمعالجة السوائل ، وتعليقها على شاكر مغناطيسي ، وقم بتخفيف الثقافات إلى حوالي واحد إلى 70 باستخدام أداة دبوس روبوتية معقمة مكونة من 96 دبوس لتثبيتها في 200 ميكرولتر من الماء المعقم.

بعد تنظيف أداة الدبوس وتعقيمها ، ضع الثقافات المخففة على ألواح الأجار. في 384 ، قم بتنسيق جيد بنقل الألواح إلى حاضنة مرطبة يتم التحكم في درجة حرارتها مع دائري أوتوماتيكي وفتحة وصول. لتصوير الثقافات ، استخدم جهاز تصوير آلي آلي ، يزيل الألواح بشكل متكرر من الحاضنة ، ويزيل الأغطية ، وينقلها إلى مساحة مضاءة بشكل موحد أسفل كاميرا 35 ملم ، ويلتقط صورة بدقة 5 ، 184 × 3 ، 456.

تحل دقة البكسل محل الغطاء، ثم تعيدها إلى دائري الحاضنة لتتبع مواقع الاستزراع على اللوحات والعلاجات المطبقة عليها. يتم ترميز الألواح تلقائيا وفقا لاسم الحاضنة ودرجة الحرارة ورقم الدفعة التسلسلية الفريدة والموضع في الحاضنة. أسماء الصور هي سلسلة من اسم اللوحة والطابع الزمني ويتم إنشاؤها تلقائيا عند التقاط الصورة.

غالبا ما يتم أيضا تصنيف اللوحات يدويا لضمان بقائها بنفس الترتيب عند النقل بين دوارات الروبوت. ملفات البيانات الوصفية هي ملفات نصية محددة بعلامات تبويب، يتم إنشاؤها يدويا. ملف الوصف التجريبي FT الثاني.

الجدول الأول فريد لكل تجربة ، ولكن يمكن إعادة استخدام وصف المكتبة FT ثلاثة ، الجدول الأول على نطاق واسع. بمجرد إنشائها ، يتم وصف التجربة في ملف الوصف التجريبي FT جدول اثنين يحتوي أحدهما على أعمدة للرمز الشريطي أو تجربة اسم اللوحة التي تم إنشاؤها تلقائيا لبدء محتويات معالجة لوحة الطابع الزمني لاسم شاشة متوسط أجار صلب ، ورقم لوحة المكتبة للمكتبات ذات اللوحات المتعددة ، ورقم الربع المتكرر للتصغير من 1 ، 536 ، تنسيق جيد إلى 384. تنسيق جيد ، يتم وصف مكتبة السلالة الإلكترونية بملف وصف المكتبة FT ثلاثة ، الجدول الأول يوضح النمط الجيني المزروع في كل موقع ثقافة.

في كل لوحة من المكتبات، تحتوي على الأعمدة الأربعة، واسم المكتبة، وORF، ولوحة أرقام اللوحة، وعمود لوحة الصف، وعمود ملاحظات اختياري. يمكن توفير ملف اسم جيني قياسي اختياري FT أربعة ، الجدول الأول يصف اسم الجين القياسي المرتبط بكل رقم ORFY منهجي ، ويحدد السلالات التي يتم فحصها. يحتوي هذا الملف على عمودين ، ORF واسم الجين لتحليل البيانات.

يتطلب سير العمل الحسابي لأكاديمية قطر الوصول إلى محطة عمل كمبيوتر متعددة النواة قوية بشكل معقول مثبتة عليها. أداة برنامج تحليل الصور المستعمر وحزمة QFAR ، وكلاهما موثق عبر الإنترنت ، متاحان مجانا ويستخدمان على مجموعة من أنظمة التشغيل. قم بتشغيل المستعمر مع كل صورة من صور اللوحة الملتقطة كمدخلات تولد ملف إخراج مستعمر واحد FT خمسة ، الجدول الأول لكل ملف إخراج مستعمر تم التقاطها ، حدد تقديرات كثافة الثقافة ، والثقافة ، والمساحة ، والشكل ، واللون.

لكل موقع من المواقع البالغ عددها 384 موقعا على لوحة الصورة، يتم نسخ اسم ملف الإخراج تلقائيا من اسم ملف الصورة المصدر. تحتوي حزمة QFAR على وظائف seldens إلى دورات زمنية لكل ثقافة لتناسب نماذج السكان اللوجستية المعممة للملاحظات والتخطيط. كلاهما يرى الشكلان الثاني والثالث على سبيل المثال.

تتم كتابة قيم المعلمات الملائمة إلى ملفات المعلمات اللوجستية لقياس الجودة. تحتوي حزمة QFAR أيضا على وظائف لمراقبة الجودة. يتم التخلص من مستعمرات الحواف بسبب زيادة توافر العناصر الغذائية عند حواف اللوحة وصعوبة تحليل الصور.

بالقرب من جدران الصفائح والثقافات ، التي فشلت في SGA والأنماط الجينية التي تعرض الارتباط مع جينات علامات الشاشة المحددة يتم تجريدها من التحليل. يتم اشتقاق العديد من مقاييس اللياقة الكمية من معلمات النموذج السكاني اللوجستي لكل ثقافة. وتشمل هذه الحد الأقصى لمعدلات مضاعفة السكان وعدد الأقسام من التلقيح إلى التشبع لكل مجموعة من الثقافات المكررة ولكل تعريف للياقة البدنية.

يتم حساب العديد من الإحصائيات الموجزة لتقديرات اللياقة المتوسطة والمتوسطة والانحراف المعياري للياقة البدنية وعدد التكرارات المرصودة. يتم إخراج الإحصائيات الموجزة إلى ملفات ملخص اللياقة البدنية لأكاديمية قطر لكرة القدم FT الثامنة ، الجدول الأول لمزيد من التحليل. على سبيل المثال ، حسابات التفاعل الجيني درجات FT تسعة الجدول الأول.

يوضح هذا الشكل منحنى نمو نموذجي واحد على مقياس لوغاريتمي OUTTA 384 QFA. الثقافات التي تنمو عند 20 درجة مئوية على أجار صلب كما هو محدد من قبل المستعمر مع زيادة في كثافة الخلايا يمكن اكتشافها لأول مرة بعد يومين تقريبا. من المحتمل أن يكون هذا التأخير تأثيرا مشتركا لمرحلة تأخر الثقافة بعد التلقيح على وسط صلب ، وحد أدنى للكشف عن كثافة الخلية.

هنا ، تم التقاط 308 منحنى نمو مماثل من لوحة واحدة. لاحظ أن السلالات التي أنتجت خطا مسطحا كانت مريضة جدا أو ميتة. يوضح هذا الشكل مقارنة بين شاشتين على مستوى الجينوم QFA لاستنتاج نقاط قوة التفاعل الجيني.

تتضمن حزمة QFAR أيضا وظائف لإنتاج رقم منحنى النمو السابق وإخراج قوائم مرتبة للأنماط الجينية التي تم فحصها وتقديرات قوة التفاعل الجيني. جنبا إلى جنب مع قيمة Q لأهمية نظم المعلومات الجغرافية المرصودة بمجرد إتقان أربعة تكرار QF على مستوى الجينوم. يمكن إكمال التجربة في غضون ثلاثة أسابيع. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون منظما في تتبع وتسمية جميع اللوحات والصور.

يجب تلقيح جميع اللوحات ووضعها في الاتجاه الصحيح وترتيب المزيد. يعتمد تحليل البيانات على صحة الملفات النصية المساعدة التي أنشأها العالم التجريبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير لياقة الآلاف من الثقافات الميكروبية المستقلة.

يتم تقدير اللياقة البدنية من خلال التصوير المتكرر للثقافات المرقطة ، والنمو على ألواح أجار صلبة ، وتحويل الصور الملتقطة إلى تقديرات لكثافة الخلايا وتوليد منحنيات النمو. توفر النمذجة الرياضية لمنحنيات النمو تقديرات الملاءمة الكمية ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لاستنتاج العلاقات الوظيفية بين المنتجات الجينية على نطاق واسع للجينوم.