تحليل كمي لياقة سير العمل

الهدف من هذا الإجراء هو رصد مستويات لياقة المزارع الميكروبية الكمية بشكل متوازٍ على نطاق الجينوم بأكمله وبطريقة دقيقة وعالية الإنتاجية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توزيع مكتبة مصفوفة من المستعمرات الميكروبية في أطباق ذات 96 بئراً وتنمية المزارع حتى الوصول إلى مرحلة التشبع. بعد ذلك، يتم تخفيف المزارع المشبعة في الماء ثم وضعها في نقاط على أطباق أغار صلبة.

بعد ذلك، يتم تصوير أطباق أغار الصلبة بشكل دوري وحتى يتشبع نمو المستعمرات الميكروبية. وأخيراً، يتم تحويل الصور التي توثق التسلسل الزمني لنمو كل مزرعة إلى مقاييس كمية لكثافة الخلايا، ثم تُلخَّص منحنيات النمو المرصودة باستخدام نماذج النمو والمقاييس الكمية للياقة الميكروبية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تقدم أدلة على التفاعلات الجينية من خلال إثبات أن السلالات الميكروبية تمتلك مستويات لياقة مختلفة، سواء عند دمجها مع طفرات مختلفة أو عند تنميتها في ظروف مختلفة.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل طرق التثبيت عالية الكثافة كطريقة SGA أو تجارب منافسة الرمز الشريطي (barcode competition)، في أن قياسات اللياقة تكون أكثر دقة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال تطوير أدوية السرطان، مثل تحديد الجينات والعمليات المهمة في الاستجابة لتلف DNA والتحكم في الدورة الخلوية، وفهم مثل هذه الأبحاث على الكائنات الدقيقة الأساسية وترجمتها إلى أهداف دوائية محتملة في الخلايا السرطانية البشرية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة التيلومير والرؤية.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على مجالات أخرى في بيولوجيا الخميرة، أو في الواقع أي مجال يمكن أن توفر فيه النماذج الظاهرية للياقة رؤى حول البيولوجيا الميكروبية. ونأمل أن يتم تطبيق QFA على العديد من الكائنات الميكروبية الأخرى التي تتوفر لها مكتبات مصفوفات. على سبيل المثال، povi e coli، أو orilla surplus. بدءاً من مستنبتات مشبعة لليلة واحدة، تم استزراع ما يصل إلى 96 سلالة خميرة مستقلة في أحجام قدرها 200 µL من وسط سائل غني.

في طبق زراعة مكون من 96 بئرًا، قم بتعقيم أداة نسخ يدوية ذات 96 مسمارًا بقطر ثُمن بوصة عن طريق غمسها أولاً في ethanol بتركيز 100%، ثم تعريضها للهب وتركها لتبرد. وزع 200 microliters من الماء المعقم في آبار طبق مكون من 96 بئرًا؛ قم بعمل vortex لمزارع الخميرة المشبعة وخففها عن طريق غمس أداة المسمار المعقمة في السلالات ثلاث مرات، ثم مرة واحدة في الطبق الذي يحتوي على الماء. قم بتعقيم أداة المسمار مجددًا، واتركها لتبرد قبل غمسها ثلاث مرات في المزارع المخففة، ثم انقل المسمار إلى طبق agar صلب.

بعد تحضين أطباق الآجار، استخدم جهاز التصوير SP من s and p robotics لتصويرها يدوياً من أجل الزراعة الآلية. ابدأ بمصفوفة مستطيلة من سلالات الخميرة المستقلة التي نمت على آجار صلب. في هذا المثال، السلالات الأولية هي نتيجة تهجين طفرة استعلام حساسة للحرارة مع مجموعة حذف الخميرة.

يتم استزراع 1,536 مزرعة تمثل أربع مكررات لـ 384 سلالة مستقلة من الخميرة على أطباق SGA باستخدام روبوت مزود بأداة نقل معقمة ذات 96 مسماراً بقطر مسمار يبلغ 1 ملم؛ حيث يتم نقل 384 من أصل 1,536 سلالة إلى 4 أطباق استزراع ذات 96 بئراً تحتوي كل منها على 200 µL من وسط انتقائي، ثم تُنمى المزارع عند درجة حرارة 20 °C حتى تصل إلى مرحلة التشبع. ولإجراء عملية التنقيط للمزارع المشبعة من الخميرة، ابدأ بنقلها إلى روبوت مناولة السوائل وإعادة تعليقها على هزاز مغناطيسي، ثم خفف المزارع إلى تركيز يتراوح حول 1:70 باستخدام أداة نقل روبوتية معقمة ذات 96 مسماراً للتنقيط في 200 µL من الماء المعقم.

بعد تنظيف وتعقيم أداة الدبوس، يتم توزيع المزارع المخففة على أطباق الآجار. وفي تنسيق يحتوي على 384 بئراً، تُنقل الأطباق إلى حاضنة مرطبة يتم التحكم في درجة حرارتها ومزودة بقرص دوار أوتوماتيكي وبوابة وصول. ولتصوير المزارع، يُستخدم جهاز تصوير آلي روبوتي، يقوم بإخراج الأطباق من الحاضنة بشكل متكرر، وإزالة الأغطية، ثم نقلها إلى مساحة مضاءة بشكل موحد أسفل كاميرا بدقة 35 مليمتر، لالتقاط صورة بدقة 5,184 في 3,456.

يقوم نظام Pixel resolution باستعادة الغطاء، ثم يعيد الأطباق إلى الدوار الخاص بالحاضنة لتتبع مواقع المزارع على الأطباق والمعاملات المطبقة عليها. يتم ترميز الأطباق تلقائياً باستخدام الرمز الشريطي (barcode) وفقاً لاسم الحاضنة، ودرجة الحرارة، ورقم تشغيلة تسلسلي فريد، وموضع الطبق في الحاضنة. أما أسماء الصور فهي عبارة عن دمج لاسم الطبق والطابع الزمني، ويتم إنشاؤها تلقائياً عند التقاط الصور.

غالبًا ما يتم وضع ملصقات يدوية على الأطباق لضمان بقائها بنفس الترتيب عند نقلها بين دوارات الروبوت. ملفات البيانات الوصفية هي ملفات نصية مفصولة بعلامات جدولة، يتم إنشاؤها يدويًا. ملف وصف التجربة FT two.

يعتبر الجدول واحد فريداً لكل تجربة، ولكن يمكن إعادة استخدام وصف المكتبة FT three، الجدول واحد على نطاق واسع. وبمجرد إنشائها، توصف التجربة في ملف الوصف التجريبي FT two الجدول واحد الذي يحتوي على أعمدة لرمز الباركود أو اسم الطبق المولد تلقائياً، والطابع الزمني لبدء التجربة، ومعالجة الطبق، ومحتويات وسط الآجار الصلب، واسم الفرز، ورقم طبق المكتبة للمكتبات التي تحتوي على أطباق متعددة، ورقم الربع المكرر لتقليل الحجم من تنسيق 1,536 well إلى تنسيق 384 well. وتوصف مكتبة e strain باستخدام ملف وصف المكتبة FT three، الجدول واحد الذي يحدد النمط الجيني المستزرع في كل موقع استنبات.

تحتوي كل لوحة في المكتبة على أربعة أعمدة: اسم المكتبة، وORF، ورقم اللوحة، والصف والعمود في اللوحة، بالإضافة إلى عمود اختياري للملاحظات. يمكن توفير ملف اختياري لأسماء الجينات القياسية FT four، الجدول 1، والذي يصف اسم الجين القياسي المرتبط بكل رقم ORF نظامي، مما يحدد السلالات التي يتم فحصها. يحتوي هذا الملف على عمودين، ORF واسم الجين، وذلك لتحليل البيانات.

يتطلب سير العمل الحسابي لـ QFA الوصول إلى محطة عمل كمبيوتر متعددة النوى ذات قدرة جيدة، يكون مثبتاً عليها كل من أداة تحليل صور المستعمرات (colonizer) وحزمة QFAR، وكلاهما متاح مجاناً وموثق عبر الإنترنت، ويعملان على مجموعة متنوعة من أنظمة التشغيل. قم بتشغيل برنامج colonizer باستخدام كل صورة من صور الأطباق الملتقطة كمدخلات، بحيث يتم إنشاء ملف مخرجات colonizer واحد لكل صورة ملتقطة؛ تحدد ملفات مخرجات colonizer تقديرات كثافة المزرعة، ومساحتها، وشكلها، ولونها.

لكل موقع من المواقع 384 على لوحة الصور، يتم نسخ اسم ملف المخرجات تلقائيًا من اسم ملف الصورة المصدر. تحتوي حزمة QFAR على وظائف seldens للمسارات الزمنية لكل مزرعة لمطابقة نماذج السكان اللوجستية المعممة مع الملاحظات ورسمها بيانيًا. انظر الشكلين اثنين وثلاثة للاطلاع على أمثلة.

تُسجل قيم المعلمات المجهزة في ملفات معلمات QFA اللوجستية. كما تحتوي حزمة QFAR على دوال لمراقبة الجودة. يتم استبعاد المستعمرات الطرفية نظرًا لتوفر العناصر الغذائية بشكل أكبر عند حواف الطبق وصعوبة تحليل الصور.

تُستبعد من التحليل المزارع القريبة من جدران الأطباق، وتلك التي فشلت في اختبار SGA، والأنماط الجينية التي أظهرت ارتباطاً بجينات العلامات الخاصة بالفحص. ويتم اشتقاق عدة مقاييس كمية للياقة من معاملات نموذج السكان اللوجستي لكل مزرعة. وتشمل هذه المقاييس أقصى معدلات تضاعف للسكان وعدد الانقسامات من وقت التلقيح حتى التشبع لكل مجموعة من المزارع المكررة ولكل تعريف للياقة.

يتم حساب عدة إحصاءات ملخصة لتقديرات اللياقة، وهي متوسط اللياقة والوسيط، والانحراف المعياري للياقة، وعدد المكررات الملحوظة. وتُخرج الإحصاءات الملخصة إلى ملفات ملخص لياقة QFA في FT eight، table one لإجراء مزيد من التحليل. على سبيل المثال، حسابات درجات التفاعل الجيني FT nine table one.

يوضح هذا الشكل منحنى نمو نموذجيًا بمقياس لوغاريتمي من جهاز 384 QFA. حيث تنمو المزارع عند درجة حرارة 20 °C على أغار صلب كما تم قياسها بواسطة colonizer، مع زيادة في كثافة الخلايا يمكن رصدها لأول مرة بعد يومين تقريبًا. ومن المرجح أن يكون هذا التأخير ناتجًا عن تأثير مشترك لمرحلة الركود في المزرعة بعد التلقيح على وسط صلب، بالإضافة إلى الحد الأدنى للكشف عن كثافة الخلايا.

هنا، تم تسجيل 308 منحنيات نمو متشابهة من طبق واحد. لاحظ أن السلالات التي أنتجت خطاً مسطحاً كانت مريضة جداً أو ميتة. يوضح هذا الشكل المقارنة بين شاشتين لتقنية QFA على نطاق الجينوم بأكمله لاستنتاج قوة التفاعل الجيني.

تتضمن حزمة QFAR أيضًا وظائف لإنتاج شكل منحنى النمو السابق، واستخراج قوائم مرتبة للأنماط الجينية المفحوصة وتقديرات لقوة التفاعل الجيني. وبالتزامن مع قيمة Q للدلالة على تفاعل GIS الملحوظ، يمكن إتمام تجربة QF.A كاملة على مستوى الجينوم بأربعة مكررات في غضون ثلاثة أسابيع بمجرد إتقان الطريقة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة التنظيم في تتبع وتسمية جميع الأطباق والصور.

يجب تلقيح جميع الأطباق وتوزيع العينات بنقاط في الاتجاه والترتيب الصحيحين للمتابعة. يعتمد تحليل البيانات على دقة ملفات النصوص المساعدة التي أعدها العالم التجريبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير لياقة الآلاف من المزارع الميكروبية المستقلة.

يتم تقدير اللياقة عن طريق تصوير المزارع المنقطة بشكل متكرر، والتي تنمو على أطباق أغار صلبة، وتحويل الصور الملتقطة إلى تقديرات لكثافة الخلايا وإنشاء منحنيات النمو. ويوفر النمذجة الرياضية لمنحنيات النمو تقديرات كمية للياقة، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لاستنتاج العلاقات الوظيفية بين نواتج الجينات على نطاق الجينوم بأكمله.