مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وقياس التغيرات في تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) من خلال تقييم تطور تكوين المستعمرات المجعدة بمرور الوقت. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية السلالات البكتيرية المستهدفة في مزرعة سائلة، ثم في الخطوة الثانية يتم وضع نقاط من هذه المزارع على أغار مغذٍ.

بعد ذلك، تتم مراقبة البقع بمرور الوقت لتحديد الوقت الذي تبدأ فيه بتطوير هياكل ثلاثية الأبعاد تشير إلى بدء تكوين مستعمرات مجعدة. وتتم مراقبة تطور مورفولوجيا المستعمرة حتى لا يتم رصد أي تغييرات إضافية. وفي النهاية، يُستخدم الفحص المجهري للبقع لإظهار الاختلافات في تطور الغشاء الحيوي بمرور الوقت بواسطة سلالات معينة أو تحت ظروف محددة بطريقة شبه كمية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتيح إجراء تحليل شبه كمي لتكون الغشاء الحيوي البكتيري باستخدام تطور مورفولوجيا المستعمرات المجعدة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول تكون الغشاء الحيوي في Vireo fishery، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لتوصيف الأنماط الظاهرية للغشاء الحيوي في أنظمة بكتيرية أخرى مثل basc وslus وpseudomonas osa وvial cholera. وقد راودتنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما حددنا طفرات بكتيرية أظهرت تأخراً في تطور تكوين المستعمرات المجعدة.

يتأثر تكوين الغشاء الحيوي (Biofilm) بشكل عام بكثافة الخلايا ومعدل النمو. لذلك، وقبل تقييم مورفولوجيا المستعمرات المجعدة، يجب تحديد معدل النمو وإنتاجية السلالات المعنية لتقدير سرعة النمو. قم بقياس الزيادة في الكثافة الضوئية أو OD لكل سلالة بمرور الوقت، وارسم منحنى نمو لتحديد الإنتاجية أو العدد النهائي للخلايا.

يمكن استخدام مقايسة صب الخلايا. يتم تنمية السلالات البكتيرية المستهدفة في مزرعة سائلة، ثم تُصب تخفيفات من هذه المزارع على أطباق الآجار. وبعد فترة التحضين، يتم حساب عدد الخلايا القابلة للحياة وتمثيلها بيانياً كما هو موضح هنا.

من المهم أيضاً تحديد أفضل ظروف التنقيط التي تُظهر أوضح الفروق بين العينة الضابطة والطفرة المستهدفة. ولتحقيق ذلك، وقبل البدء بتنقيط سلالات النمو في المزارع السائلة تحت ظروف متنوعة، مثل الأوساط الغذائية أو درجات الحرارة المختلفة، وفي مراحل نمو متباينة، مثل المرحلة الأسية أو طور السكون، يتم تنقيط 10 µL من المزرعة بكثافات خلوية مختلفة على الأوساط الغذائية المناسبة، ثم تُحضن في درجة الحرارة المطلوبة حتى تصبح مورفولوجيا المستعمرات واضحة. وبهذه الطريقة، يمكن تحديد القيمة المثلى للكثافة الضوئية (OD) الابتدائية لمجموعة معينة من السلالات أو الظروف للبدء في هذا الإجراء.

قم بتلقيح خلايا v Fisher eye من أطباق الآجار في 5 mL من وسط LB salt أو وسط LBS الذي يحتوي على أي مضادات حيوية ضرورية، ثم قم بالتحضين مع الرج عند 28 °C طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، قم باستزراع الخلايا مرة أخرى بتخفيف بنسبة 1:100 في 5 mL من وسط LBS طازج، ثم حضنها تحت نفس الظروف حتى تصل الخلايا إلى قيمة OD المطلوبة عند 600 nm. بالنسبة لبكتيريا Vibrio fii، يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم إنتاج البقع من مستنبتات بقيمة OD تقارب 0.2. بعد ذلك، انقل 1 mL من كل مستنبت إلى أنبوب طرد مركزي صغير (microfuge tube) وقم بالطرد المركزي بأقصى سرعة.

لمدة دقيقة واحدة، قم بإزالة السائل الطافي عن طريق الشفط وأعد تعليق الراسب في 1 mL من مياه البحر الاصطناعية المعقمة بتركيز 70% أو في جهاز طرد مركزي SW. ستعمل خطوة الغسل هذه، مرة أخرى، على إزالة بقايا الوسط والمكونات خارج الخلوية. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الراسب المغسول في 1 mL من 70%A SW للتأكد من أن كل عينة تحتوي على عدد الخلايا المقدر بواسطة OD عند 600 nm.

قم بإجراء أي تعديلات ضرورية عن طريق تخفيف العينات الأكثر تركيزاً باستخدام بقعة إضافية من 70%A SW، ثم ضع 10 microliters من كل مزرعة على أطباق LBS التي تحتوي على أي مضادات حيوية ضرورية. تأكد من توجيه الماصة بإصبعك فوق سطح الآجار مباشرة والتقطير بشكل عمودي وليس بزاوية. أفرغ السائل ببطء لضمان توزيع البقعة بشكل متجانس، مع تضمين الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة على نفس الطبق.

عند تقييم تكوين المستعمرات المجعدة في الأطباق الثانوية، قد يؤثر التباين في AFL على تطور الغشاء الحيوي. ويتمثل الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في تحديد بداية تكوين المستعمرات المجعدة، حيث لا يظهر ذلك أحياناً إلا بعد حدوث التطور.

لالتقاط بداية تطور مستعمرات التجاعيد، نأخذ نقاط زمنية كل ساعة ضمن إطار زمني محدد. يتيح لنا ذلك أيضاً العودة وإجراء مقارنات بعد بدء التطور. ولضمان بقاء المزرعة المنقّطة موزعة بشكل متساوٍ، اترك النقطة لتجف قبل نقل الطبق إلى الحاضنة، ثم اقلب الأطباق واحضنها عند 28 درجة Celsius.

تتمثل إحدى طرق تقييم مورفولوجيا المزارع المنقطة في استخدام مقايسة نقطة النهاية، والتي تتضمن تقييم تكوين المستعمرات المجعدة عند نقطة زمنية محددة مسبقاً بعد التنقيط. هذه نتيجة نموذجية من مقايسة نقطة النهاية التي تم فيها تقييم تكوين المستعمرات المجعدة. بعد 40 ساعة من التنقيط، تظهر سلالة من Vibrio FII غير مكونة للغشاء الحيوي على اليسار، بينما تظهر سلالة مكونة للغشاء الحيوي على اليمين.

يُعد مقايسة النهاية مفيدة للسلالات التي تظهر، أو يُقترح أن تظهر، عيوباً شديدة في تكوين الغشاء الحيوي الرقيق. وهناك مقايسة أخرى لتقييم مورفولوجيا المستعمرات وهي مقايسة المجرى الزمني، والتي يتم فيها تقييم تكوين المستعمرات المجعدة على مدى فترة زمنية بعد عملية التنقيط لتتبع الوقت المنقضي بعد التنقيط بسهولة. اضبط مؤقتاً للعد التصاعدي.

في هذا العرض التوضيحي، سيتم مراقبة مورفولوجيا البقعة النامية كل ساعة، بدءاً من 12 إلى 15 ساعة بعد التبقيع، وذلك باستخدام مجهر تشريحي مزود بملحق كاميرا والتقاط الصور وتحليلها. تُستخدم البرامج الحاسوبية لمراقبة وتوثيق مورفولوجيا المستعمرة ولتقييم بداية وتطور تكوين المستعمرات المجعدة. وقبل تصوير المزارع المبقّعة، يتم عادةً إزالة غطاء طبق بيتري للحصول على أوضح صورة ممكنة.

هنا، يتم إضاءة البقع من الأسفل عبر منصة زجاجية شفافة باستخدام مصدر ضوء بارد، بينما يتم التقاط الصور من الأعلى. يعد هذا الإعداد مثاليًا لتصوير تطور المستعمرات المجعدة لأن مستعمرات *Vibrio fischeri* تكون شفافة. ولتحقيق أفضل رؤية لتطور المستعمرات المجعدة، اضبط كل من كثافة الإضاءة وزاوية الانعكاس أسفل المستعمرات البكتيرية بحيث يمكن تمييز المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية النامية.

حدد ظروف الإضاءة المثلى التي توفر أقوى تباين بين المستعمرة المنقطة وخلفية الآجار المحيطة. من المهم استخدام نفس قوة التكبير عند التقاط الصور طوال التجربة باستخدام الرافعة الموجودة في الجزء الخلفي من الكاميرا، وقم بتحويل العرض من عدسة المجهر العينية إلى شاشة الكمبيوتر، ثم اضبط الرؤية والتركيز وفقاً لذلك، وبعد ذلك التقط الصورة؛ التقط صوراً مناسبة لتوثيق بداية وتطور تكوين المستعمرات المجعدة. تنتهي التجربة عندما لا يحدث أي تطور إضافي في الغشاء الحيوي.

في نهاية التجارب التي تم إجراؤها، يتم تجميع الصور في أشكال توضيحية لتصور تطور النمط بمرور الوقت لكل سلالة أو حالة. لاحظ مقدار الوقت الذي ينقضي من وقت التلقيح إلى الوقت الذي يبدأ فيه تكوين المستعمرات المجعدة؛ حيث يُحدد بدء تكوين المستعمرات المجعدة عند النقطة الزمنية التي يظهر فيها تكوين الأنماط والهياكل ثلاثية الأبعاد لأول مرة. في هذا المثال، يكون بدء تكوين الغشاء الحيوي واضحاً عند 12 ساعة لسلالة ضابطة من Vibrio FII قادرة على تكوين الغشاء الحيوي، كما هو موضح في اللوحة العلوية.

في اللوحة السفلية، تظهر صور تمثيلية لسلالة طافرة من Vibrio FII تظهر تأخراً لمدة أربع ساعات في بدء تكوين المستعمرات المجعدة بمرور الوقت، حيث بدأ تكوين الغشاء الحيوي بعد 16 ساعة من التلقيح. يُلاحظ أنه بينما تظهر فروق طفيفة بين هذه السلالات في النقاط الزمنية المبكرة عند 40 ساعة، تبدو السلالات متشابهة من حيث كثافة ونمط تكوين الغشاء الحيوي في كل نقطة زمنية تلت بدء تكوين المستعمرات المجعدة. يجب ملاحظة نمط تطور المستعمرات المجعدة.

قد يتطور الهيكل من الخارج إلى الداخل كما هو موضح في اللوحة A، أو قد يتطور من الداخل إلى الخارج كما هو موضح في اللوحة B. يوفر هذا التقييم آلية للتمييز بين الأغشية الحيوية التي تشكلها سلالات مختلفة أو التي تتكون تحت ظروف مختلفة. أما المقياس شبه الكمي الثاني لتشكل الغشاء الحيوي فيعتمد على تغير قطر المستعمرة النامية بمرور الوقت. وكما هو موضح في اللوحة العلوية، تشكل سلالة نموذجية ذات كفاءة في تكوين الغشاء الحيوي مستعمرات تزداد في التعقيد والقطر.

في المقابل، لا تشكل سلالة أخرى موضحة في اللوحة السفلية أغشية حيوية. وأخيرًا، يوضح هذا الشكل تمثيلاً رسوميًا للزيادة في قطر المستعمرة بمرور الوقت. وبالنسبة للسلالتين ذاتهما، تُمثل السلالة القادرة على تكوين الغشاء الحيوي بدوائر بيضاء.

بينما تُمثَّل السلالة التي لا تُكوّن أغشية حيوية بمربعات سوداء. وقد كشف هذا التحليل أن حجم المستعمرات القادرة على تكوين الغشاء الحيوي يزداد بمعدل أكبر من المستعمرات السلبية لتكوين الغشاء الحيوي، وفي النقطة الزمنية النهائية، اختلف الاثنان بمقدار الضعف تقريبًا. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر وضع كل سلالة بدقة وتوثيق تكوين المستعمرة المجعدة الأولية لكل سلالة.

باتباع هذا البروتوكول، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة iCal أو الصبغ الشامل للبلورات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول العمليات المعنية وتكون الغشاء الحيوي.