Name: مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: تعلم طريقة شبه كميّة لدراسة تكوين البيوفيلم عبر مراقبة تطور المستعمرات المتجعدة باستخدام المجهر المكشوف. تتيح هذه التقنية للباحثين مقارنة السلالات البكتيرية المختلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل NHI R01 منحة GM59690 منحت لKLV.

<ol><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li>
<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187(2002).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20(2005).</li>
<li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li>
<li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae%3A+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT%2C+vpsR%2C+and+hapR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388(2007).</li>
<li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160(2005).</li>
<li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li>
<li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus%2C+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li>
<li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114(2011).</li>
<li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113(2002).</li>
<li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+%C3%8F%C6%9254-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ïƒ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485(2005).</li>
<li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215(2009).</li>
<li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986(1994).</li>
<li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437(2008).</li>
<li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866(2010).</li>
<li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rdar+morphotype%2C+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234(2005).</li>
<li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888(2006).</li>
<li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117(2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا العمل، ونحن وصفا لطريقة شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri بوصفه الكائن نموذج. على وجه التحديد، ونحن الاستفادة من مجهر تشريح مع المرفقات كاميرا لمراقبة تشكيل بيوفيلم والتنمية وتشكيل مستعمرة التجاعيد مع مرور الوقت على سطح صلب أجار. في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة 2 أنواع محددة من الطرق التي نستخدمها عادة لتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. الأول هو فحص نقطة النهاية، والذي يتيح لنا مراقبة، شامل نهائي الهندسة المعمارية 3D، والزخرفة، وقطر لثقافة رصدت في &quot;النهائي&quot; المحدد نقطة مرة. هذا النهج هو أكثر فائدة لتقييم سلالات متحولة أو الظروف التي تؤدي إلى تشوهات كبيرة في تشكيل بيوفيلم. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يميز بين الاختلافات أكثر دهاء وقعت في نقطة زمنية قبل نقطة النهاية المحددة. على نحو أوثق مراقبة التجاعيد تشكيل مستعمرة، نستخدم فحص مسار الزمن، والتي تتيح لنا التعرف بداية ثrinkled تشكيل مستعمرة ومراقبة تطورها على مر الزمن. نتيجة لهذا النهج، يمكن تحديد الاختلافات أكثر دهاء في توقيت تشكيل مستعمرة التجاعيد، والهندسة المعمارية 3D، والزخرفة. استخدمنا هذا الفحص بالطبع وقت لتوليد المؤسستين شبه كمي المقايسات من تشكيل بيوفيلم. أولا، يمكن مقارنة الوقت الذي سلالة يبدأ في تطوير الهندسة المعمارية 3D إلى أن سلالات السيطرة. لقد وجدنا أن التأخير في تشكيل بيوفيلم من متحولة خاصة في ظل نفس الظروف ويتسق إلى حد ما 9. على سبيل المثال، في البيانات التي تظهر في الشكل. 2، ومتحولة برهنوا دائما عن تأخير ح 4 في الشروع في تشكيل بيوفيلم. ثانيا شبه كمي قدر من تشكيل بيوفيلم هو التغير في حجم القطر من مستعمرة التجاعيد (سبوت). لقد وجدنا أن قطر المستعمرات التجاعيد تختلف تدريجيا من أن من غير بيوفيلم المستعمرات، ليبلغ نحو فرقا 2-أضعاف في نهاية الوقت نقطة (الشكل 3 </قوي&gt;) (موريس وVisick، بيانات غير منشورة). حتى الآن، ونحن لم احظ أحد النمط الظاهري دون الآخر (أي تشكيل بيوفيلم دون زيادة في القطر مستعمرة) (بيانات غير منشورة)، على الرغم من أنه لا يزال ممكنا بعض المسوخ وسوف تتصرف بشكل مختلف. في الواقع، فقد أفيد عن V. الكوليرا أن بعض التجاعيد في المستعمرات نتيجة زيادة كبيرة في القطر مستعمرة في حين أن البعض الآخر لا 15. ومع ذلك، يمكن تقييم التغيير في قطر مع مرور الوقت مساعدة في توصيف المسوخ بيوفيلم المحتملة و / أو توفير تدبير إضافي الكمية من المسوخ مع التأخير في عملية التنمية. من التدابير اثنين من تشكيل بيوفيلم (الوقت وقطر)، وتحديد بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد أكثر حساسية، ولكن أيضا أكثر ذاتية، من تحديد القطر من بقعة. وحتى مع ذلك، على حد سواء التدابير تقديم تقييم نصف الكمية من النمط الظاهري يمكن أن يكون مفيدا للغاية للباحثين بيوفيلم لكن غير قابلة بسهولة إلى quantificatioن. عند إجراء فحوصات مثقف رصدت، من المهم للنظر في الظروف البيئية التي يتم استزراع سلالات رصدت. ويتأثر في كثير من الأحيان التجاعيد تشكيل مستعمرة من قبل الظروف البيئية المختلفة، بما في ذلك توفر المواد الغذائية، ودرجة الحرارة والرطوبة. للحد من التباين بين التجارب، فإنه من المفيد لتوحيد هذه الظروف قدر المستطاع (أي توحيد لوحات أجار إلى وحدة تخزين مجموعة وزراعة سلالات رصدت في درجة الحرارة التي تسيطر عليها). لمزيد من السيطرة على التباين بين التجارب اكتشاف، من المهم أن تشمل سلالات المراقبة المناسبة داخل كل مجموعة من التجارب. أخيرا، عند تفسير البيانات من هذه المقايسات، فمن الضروري إجراء أية تجربة 1 عدة مرات (3 +)، وخصوصا عندما تقييم الفروق الدقيقة في تشكيل مستعمرة التجاعيد (على سبيل المثال، في تأخير تشكيل بيوفيلم أو الاختلافات الزخرفة). بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي: 1) determinقد جي ما إذا كانت الخلايا لديها خلل في النمو يكون من الصعب: نمو الخلايا في ثقافة السائل قد لا تعكس بدقة معدلات النمو في وسائل الاعلام الصلبة، وتحديد دقيق لنمو الخلايا المكونة للبيوفيلم، والتي قد تلتصق ببعضها البعض، قد لا يكون ممكنا؛ 2) سوف سلالات مع عيوب نمو أن يكون مشكلة لتحليل، 3) أنه قد لا يكون من الممكن التمييز بين الاختلافات بين سلالات قطر مع الظواهر بيوفيلم خفية، 4) عن السلالات التي لا تنمو في حلقة مركزية من أنه قد لا يكون من الممكن قياس بدقة تغييرات في قطر، 5) في حين يمكن ملاحظة الزخرفة خلال تشكيل بيوفيلم، لا توجد وسيلة لقياس الزخرفة للبيوفيلم الناتجة عن ذلك؛ و 6) لا توجد وسيلة لقياس Z-البعد عن بيوفيلم مع هذه التجربة انشاء . على الرغم من هذه القيود، يتيح هذا البروتوكول مع ذلك وسيلة للحصول على البيانات الرقمية للمساعدة في تقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. في هذا البروتوكول، ونحن الاستفادة من التصوير محددنظام (أي مجهر زايس تشريح وبروخرس CapturePro برامج التصوير) لمراقبة وتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. نظام التصوير وصفها هنا هي قوية: القدرة على الكشف عن بدء تشكيل مستعمرة التجاعيد، وبالتالي تقييم تطور مع الوقت نهج بطبيعة الحال، تتعزز بشكل كبير من خلال استخدام مجهر تشريح. ومع ذلك، إذا كانت هذه التكنولوجيا غير متوفرة، ويمكن تكييفها لبروتوكول للاستخدام مع غيرها من المعدات، بما في ذلك كاميرا رقمية بسيطة، مع التركيز التكبير. في حين أن هذا البروتوكول يركز على تقييم تنمية مستعمرة التجاعيد، يمكن أيضا أن يكون تعديل لتقييم تكوين غشاء رقيق، وهو شكل من بيوفيلم أن يتطور عندما الخلايا تنمو بشكل ثابت في ثقافة السائل. قد يكون هذا البروتوكول يثبت أيضا مفيدة في تقييم المؤشرات الأخرى من تشكيل بيوفيلم، بما في ذلك إدراج الأصباغ محددة في المستعمرات رصدت خلال تطوير بيوفيلم. وتشمل هذه، ولكنها لا تقتصر على والأصباغ مثل الأحمر والكونغو calcofluأو التي يمكن أن تربط إلى السليلوز، وهو عنصر مشترك من الأغشية الحيوية البكتيرية 16. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول، على الرغم من أن وضعت للاستخدام مع خامسا على سبيل المثال لا fischeri، لهذا الكائن الحي ولكن يمكن تعميمها على دراسة تشكيل بيوفيلم في الكائنات عديدة مختلفة، مثل العصوية الرقيقة 4، الضمة الكوليرية 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، والزائفة الزنجارية 7، والتي تشكل كل معرض مستعمرة التجاعيد. وأخيرا، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة morphologies مستعمرة الأخرى التي لها نمط النمو، مثل، ربما، والزخرفة التي تحدث أثناء نمو زانثس Myxococcus 17 و جوي تطوير هيكل في الزائفة الزنجارية 18. هذا البروتوكول هو بالتالي من استخدام العام للباحثين علم الأحياء المجهرية وبيوفيلم.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> زييس stemi 2000-C تشريح مجهر </td><td> زييس </td><td> 45505300000000000 </td><td> (الحصول عليها من خلال مجهر لوكاس) </td></tr><tr><td> بروخرس C10 PLUS </td><td> JENOPTIK بصري أنظمة شركة محدودة </td><td> 017953-602-26 </td><td> كاميرا المرفق (التي تم الحصول عليها من خلال مجهر لوكاس) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC الباردة مصدر الضوء </td><td> زييس </td><td> 4355400000000000 </td><td> (الحصول عليها من خلال مجهر لوكاس) </td></tr><tr><td> بروخرس CapturePro </td><td> JENOPTIK بصري أنظمة شركة محدودة </td><td> البرمجيات الحرة مع الكاميرا المسجلة </td><td> برنامج كمبيوتر لالتقاط الصور </td></tr><tr><td> صورة J </td><td> المعاهد الوطنية للصحة </td><td> البرمجيات الحرة من:ط / download.html &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> برنامج كمبيوتر لقياس قطرها </td></tr></tbody></table>

مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

الأغشية الحيوية، أو سطح المرفقة المجتمعات من خلايا مغلفة في المصفوفة خارج الخلية، وتمثل نمط حياة مشتركة لالعديد من أنواع البكتيريا. في غضون بيوفيلم، الخلايا البكتيرية في كثير من الأحيان معرض للتغيير علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك تعزيز المقاومة للمضادات الحيوية وغيرها من الضغوط البيئية 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأغشية الحيوية تلعب دورا هاما في استضافة ميكروب التفاعلات. الأغشية الحيوية تتطور عندما البكتيريا الانتقال من الفردية، وخلايا العوالق لتشكيل معقدة، متعددة الخلايا المجتمعات 2. في المختبر، يتم دراسة الأغشية الحيوية من خلال تقييم تطور الظواهر بيوفيلم محددة. النمط الظاهري بيوفيلم مشترك ينطوي على تشكيل مستعمرات البكتيريا التجاعيد أو مغضن على أجار صلب وسائل الإعلام 3. التجاعيد تشكيل مستعمرة يوفر وسيلة بسيطة للغاية ومفيدة لتحديد وتوصيف سلالات بكتيرية واظهار الظواهر بيوفيلم تتغير، والتحقيق في الظروف البيئية التي تؤثر على تشكيل بيوفيلم. WRInkled تشكيل مستعمرة تخدم كمؤشر على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا إيجابية الجرام على حد سواء، مثل العصوية الرقيقة 4، والبكتيريا سالبة الجرام، مثل الكوليرا الضمة 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، الزائفة الزنجارية 7، و الضمة fischeri 8. هذه البكتيريا البحرية V. لقد أصبح fischeri نموذجا لتشكيل بيوفيلم نظرا للدور الحاسم من خلال الأغشية الحيوية الاستعمار المضيف: الأغشية الحيوية التي تنتجها V. fischeri تعزيز استعمارها من هاواي قصير الذيل 8-10 الحبار scolopes Euprymna. الأهم من ذلك، لاحظ الظواهر بيوفيلم في المختبر ترتبط قدرة V. خلايا fischeri لاستعمار على نحو فعال الحيوانات المضيف: سلالات ضعاف لتشكيل بيوفيلم في المختبر تملك عيب الاستعمار 9،11، في حين زادت الضغوط العارضةوتتعزز الظواهر بيوفيلم عن الاستعمار 8،12. V. fischeri بالتالي يوفر النظام نموذج بسيط لتقييم الآليات التي تنظم تشكيل بيوفيلم البكتيريا وكيف الأغشية الحيوية تأثير الاستعمار المضيف. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri كنظام نموذج. هذا الأسلوب ينطوي على الحذر اكتشاف الثقافات البكتيرية بتركيزات محددة وحدات التخزين على وسائط أجار الصلبة؛ ثقافة المرقطة هو مرادف لمستعمرة بكتيرية واحدة. ويمكن استخدام هذه التقنية &quot;ثقافة رصدت&quot; للمقارنة بين الظواهر بيوفيلم الإجمالي في، واحد نقاط محددة من الوقت (نقطة النهاية المقايسات)، أو لتحديد وتوصيف الظواهر بيوفيلم خفية من خلال الوقت طبعا المقايسات للتنمية بيوفيلم وقياسات القطر مستعمرة ، ويتأثر التي كتبها تشكيل بيوفيلم. وبالتالي، هذا الأسلوب يوفر تحليل شبه كمي لتشكيل بيوفيلم، فيmitting تقييم للتوقيت والزخرفة للتنمية مستعمرة التجاعيد والحجم النسبي للبنية النامية، والخصائص التي تمتد إلى ما بعد التشكل مجمل بسيط.

ونحن نقدم بسيطة، وشبه كمي للتحقيق في طريقة تشكيل بيوفيلم<em&gt; في المختبر</em&gt;. هذا الأسلوب يستفيد من stemi زايس 2000-C تشريح مجهر (مرفق مع الكاميرا) لمراقبة كلا من توقيت ونمط تشكيل بيوفيلم، وفقا لتقييم وضع المستعمرات التجاعيد.

تمثل الأغشية الحيوية، أو المجتمعات الخلوية الملتصقة بالأسطح والمغلفة بمصفوفة خارج خلوية، نمط حياة شائعاً للعديد من البكتيريا. وضمن...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وقياس التغيرات في تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) من خلال تقييم تطور تكوين المستعمرات المجعدة بمرور الوقت. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية السلالات البكتيرية المستهدفة في مزرعة سائلة، ثم في الخطوة الثانية يتم وضع نقاط من هذه المزارع على أغار مغذٍ.بعد ذلك، تتم مراقبة البقع بمرور الوقت لتحديد الوقت الذي تبدأ فيه بتطوير هياكل ثلاثية الأبعاد تشير إلى بدء تكوين مستعمرات مجعدة. وتتم مراقبة تطور مورفولوجيا المستعمرة حتى لا يتم رصد أي تغييرات إضافية. وفي النهاية، يُستخدم الفحص المجهري للبقع لإظهار الاختلافات في تطور الغشاء الحيوي بمرور الوقت بواسطة سلالات معينة أو تحت ظروف محددة بطريقة شبه كمية.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتيح إجراء تحليل شبه كمي لتكون الغشاء الحيوي البكتيري باستخدام تطور مورفولوجيا المستعمرات المجعدة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول تكون الغشاء الحيوي في Vireo fishery، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لتوصيف الأنماط الظاهرية للغشاء الحيوي في أنظمة بكتيرية أخرى مثل basc وslus وpseudomonas osa وvial cholera. وقد راودتنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما حددنا طفرات بكتيرية أظهرت تأخراً في تطور تكوين المستعمرات المجعدة.يتأثر تكوين الغشاء الحيوي (Biofilm) بشكل عام بكثافة الخلايا ومعدل النمو. لذلك، وقبل تقييم مورفولوجيا المستعمرات المجعدة، يجب تحديد معدل النمو وإنتاجية السلالات المعنية لتقدير سرعة النمو. قم بقياس الزيادة في الكثافة الضوئية أو OD لكل سلالة بمرور الوقت، وارسم منحنى نمو لتحديد الإنتاجية أو العدد النهائي للخلايا.يمكن استخدام مقايسة صب الخلايا. يتم تنمية السلالات البكتيرية المستهدفة في مزرعة سائلة، ثم تُصب تخفيفات من هذه المزارع على أطباق الآجار. وبعد فترة التحضين، يتم حساب عدد الخلايا القابلة للحياة وتمثيلها بيانياً كما هو موضح هنا.من المهم أيضاً تحديد أفضل ظروف التنقيط التي تُظهر أوضح الفروق بين العينة الضابطة والطفرة المستهدفة. ولتحقيق ذلك، وقبل البدء بتنقيط سلالات النمو في المزارع السائلة تحت ظروف متنوعة، مثل الأوساط الغذائية أو درجات الحرارة المختلفة، وفي مراحل نمو متباينة، مثل المرحلة الأسية أو طور السكون، يتم تنقيط 10 µL من المزرعة بكثافات خلوية مختلفة على الأوساط الغذائية المناسبة، ثم تُحضن في درجة الحرارة المطلوبة حتى تصبح مورفولوجيا المستعمرات واضحة. وبهذه الطريقة، يمكن تحديد القيمة المثلى للكثافة الضوئية (OD) الابتدائية لمجموعة معينة من السلالات أو الظروف للبدء في هذا الإجراء.قم بتلقيح خلايا v Fisher eye من أطباق الآجار في 5 mL من وسط LB salt أو وسط LBS الذي يحتوي على أي مضادات حيوية ضرورية، ثم قم بالتحضين مع الرج عند 28 °C طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، قم باستزراع الخلايا مرة أخرى بتخفيف بنسبة 1:100 في 5 mL من وسط LBS طازج، ثم حضنها تحت نفس الظروف حتى تصل الخلايا إلى قيمة OD المطلوبة عند 600 nm. بالنسبة لبكتيريا Vibrio fii، يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم إنتاج البقع من مستنبتات بقيمة OD تقارب 0.2. بعد ذلك، انقل 1 mL من كل مستنبت إلى أنبوب طرد مركزي صغير (microfuge tube) وقم بالطرد المركزي بأقصى سرعة.لمدة دقيقة واحدة، قم بإزالة السائل الطافي عن طريق الشفط وأعد تعليق الراسب في 1 mL من مياه البحر الاصطناعية المعقمة بتركيز 70% أو في جهاز طرد مركزي SW. ستعمل خطوة الغسل هذه، مرة أخرى، على إزالة بقايا الوسط والمكونات خارج الخلوية. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الراسب المغسول في 1 mL من 70%A SW للتأكد من أن كل عينة تحتوي على عدد الخلايا المقدر بواسطة OD عند 600 nm.قم بإجراء أي تعديلات ضرورية عن طريق تخفيف العينات الأكثر تركيزاً باستخدام بقعة إضافية من 70%A SW، ثم ضع 10 microliters من كل مزرعة على أطباق LBS التي تحتوي على أي مضادات حيوية ضرورية. تأكد من توجيه الماصة بإصبعك فوق سطح الآجار مباشرة والتقطير بشكل عمودي وليس بزاوية. أفرغ السائل ببطء لضمان توزيع البقعة بشكل متجانس، مع تضمين الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة على نفس الطبق.عند تقييم تكوين المستعمرات المجعدة في الأطباق الثانوية، قد يؤثر التباين في AFL على تطور الغشاء الحيوي. ويتمثل الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في تحديد بداية تكوين المستعمرات المجعدة، حيث لا يظهر ذلك أحياناً إلا بعد حدوث التطور.لالتقاط بداية تطور مستعمرات التجاعيد، نأخذ نقاط زمنية كل ساعة ضمن إطار زمني محدد. يتيح لنا ذلك أيضاً العودة وإجراء مقارنات بعد بدء التطور. ولضمان بقاء المزرعة المنقّطة موزعة بشكل متساوٍ، اترك النقطة لتجف قبل نقل الطبق إلى الحاضنة، ثم اقلب الأطباق واحضنها عند 28 درجة Celsius.تتمثل إحدى طرق تقييم مورفولوجيا المزارع المنقطة في استخدام مقايسة نقطة النهاية، والتي تتضمن تقييم تكوين المستعمرات المجعدة عند نقطة زمنية محددة مسبقاً بعد التنقيط. هذه نتيجة نموذجية من مقايسة نقطة النهاية التي تم فيها تقييم تكوين المستعمرات المجعدة. بعد 40 ساعة من التنقيط، تظهر سلالة من Vibrio FII غير مكونة للغشاء الحيوي على اليسار، بينما تظهر سلالة مكونة للغشاء الحيوي على اليمين.يُعد مقايسة النهاية مفيدة للسلالات التي تظهر، أو يُقترح أن تظهر، عيوباً شديدة في تكوين الغشاء الحيوي الرقيق. وهناك مقايسة أخرى لتقييم مورفولوجيا المستعمرات وهي مقايسة المجرى الزمني، والتي يتم فيها تقييم تكوين المستعمرات المجعدة على مدى فترة زمنية بعد عملية التنقيط لتتبع الوقت المنقضي بعد التنقيط بسهولة. اضبط مؤقتاً للعد التصاعدي.في هذا العرض التوضيحي، سيتم مراقبة مورفولوجيا البقعة النامية كل ساعة، بدءاً من 12 إلى 15 ساعة بعد التبقيع، وذلك باستخدام مجهر تشريحي مزود بملحق كاميرا والتقاط الصور وتحليلها. تُستخدم البرامج الحاسوبية لمراقبة وتوثيق مورفولوجيا المستعمرة ولتقييم بداية وتطور تكوين المستعمرات المجعدة. وقبل تصوير المزارع المبقّعة، يتم عادةً إزالة غطاء طبق بيتري للحصول على أوضح صورة ممكنة.هنا، يتم إضاءة البقع من الأسفل عبر منصة زجاجية شفافة باستخدام مصدر ضوء بارد، بينما يتم التقاط الصور من الأعلى. يعد هذا الإعداد مثاليًا لتصوير تطور المستعمرات المجعدة لأن مستعمرات *Vibrio fischeri* تكون شفافة. ولتحقيق أفضل رؤية لتطور المستعمرات المجعدة، اضبط كل من كثافة الإضاءة وزاوية الانعكاس أسفل المستعمرات البكتيرية بحيث يمكن تمييز المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية النامية.حدد ظروف الإضاءة المثلى التي توفر أقوى تباين بين المستعمرة المنقطة وخلفية الآجار المحيطة. من المهم استخدام نفس قوة التكبير عند التقاط الصور طوال التجربة باستخدام الرافعة الموجودة في الجزء الخلفي من الكاميرا، وقم بتحويل العرض من عدسة المجهر العينية إلى شاشة الكمبيوتر، ثم اضبط الرؤية والتركيز وفقاً لذلك، وبعد ذلك التقط الصورة؛ التقط صوراً مناسبة لتوثيق بداية وتطور تكوين المستعمرات المجعدة. تنتهي التجربة عندما لا يحدث أي تطور إضافي في الغشاء الحيوي.في نهاية التجارب التي تم إجراؤها، يتم تجميع الصور في أشكال توضيحية لتصور تطور النمط بمرور الوقت لكل سلالة أو حالة. لاحظ مقدار الوقت الذي ينقضي من وقت التلقيح إلى الوقت الذي يبدأ فيه تكوين المستعمرات المجعدة؛ حيث يُحدد بدء تكوين المستعمرات المجعدة عند النقطة الزمنية التي يظهر فيها تكوين الأنماط والهياكل ثلاثية الأبعاد لأول مرة. في هذا المثال، يكون بدء تكوين الغشاء الحيوي واضحاً عند 12 ساعة لسلالة ضابطة من Vibrio FII قادرة على تكوين الغشاء الحيوي، كما هو موضح في اللوحة العلوية.في اللوحة السفلية، تظهر صور تمثيلية لسلالة طافرة من Vibrio FII تظهر تأخراً لمدة أربع ساعات في بدء تكوين المستعمرات المجعدة بمرور الوقت، حيث بدأ تكوين الغشاء الحيوي بعد 16 ساعة من التلقيح. يُلاحظ أنه بينما تظهر فروق طفيفة بين هذه السلالات في النقاط الزمنية المبكرة عند 40 ساعة، تبدو السلالات متشابهة من حيث كثافة ونمط تكوين الغشاء الحيوي في كل نقطة زمنية تلت بدء تكوين المستعمرات المجعدة. يجب ملاحظة نمط تطور المستعمرات المجعدة.قد يتطور الهيكل من الخارج إلى الداخل كما هو موضح في اللوحة A، أو قد يتطور من الداخل إلى الخارج كما هو موضح في اللوحة B. يوفر هذا التقييم آلية للتمييز بين الأغشية الحيوية التي تشكلها سلالات مختلفة أو التي تتكون تحت ظروف مختلفة. أما المقياس شبه الكمي الثاني لتشكل الغشاء الحيوي فيعتمد على تغير قطر المستعمرة النامية بمرور الوقت. وكما هو موضح في اللوحة العلوية، تشكل سلالة نموذجية ذات كفاءة في تكوين الغشاء الحيوي مستعمرات تزداد في التعقيد والقطر.في المقابل، لا تشكل سلالة أخرى موضحة في اللوحة السفلية أغشية حيوية. وأخيرًا، يوضح هذا الشكل تمثيلاً رسوميًا للزيادة في قطر المستعمرة بمرور الوقت. وبالنسبة للسلالتين ذاتهما، تُمثل السلالة القادرة على تكوين الغشاء الحيوي بدوائر بيضاء.بينما تُمثَّل السلالة التي لا تُكوّن أغشية حيوية بمربعات سوداء. وقد كشف هذا التحليل أن حجم المستعمرات القادرة على تكوين الغشاء الحيوي يزداد بمعدل أكبر من المستعمرات السلبية لتكوين الغشاء الحيوي، وفي النقطة الزمنية النهائية، اختلف الاثنان بمقدار الضعف تقريبًا. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر وضع كل سلالة بدقة وتوثيق تكوين المستعمرة المجعدة الأولية لكل سلالة.باتباع هذا البروتوكول، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة iCal أو الصبغ الشامل للبلورات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول العمليات المعنية وتكون الغشاء الحيوي.

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويصف وسائل الفحص السريع لقياس وقت مبكر تشكيل بيوفيلم في البكتيريا والفطريات. يستخدم هذا الأسلوب لوحة microtiter كما التحتية لتشكيل بيوفيلم الميكروبية ، وبيوفيلم هو تصور استخدام الكريستال سلالة البنفسجي. في مقايسة يوفر إما فحص نوعي أو كمي لتشكيل بيوفيلم في وقت مبكر.

Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص

توضح هذه المقالة إجراءات لتشكيل والتصور لبيوفيلم البكتيريا نما داخل الشريحة الغرفة 8...

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

المصدر: بوخر، ت.، وآخرون، منهجيات دراسة أغشية B. subtilis كنموذج لتوصيف مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp.(2016)يوضح هذا الفيديو تحضير مستعمرات الأغشية الحيوية البكتيرية الناضجة للتصوير عالي الدقة. يغطي خطوات التثبيت، والتجفيف، والتثبيت، وطلاء المعادن للحفاظ على شكل الأغشية الحيوية وتصورها.

تحضير مستعمرات الأغشية الحيوية البكتيرية للتحليل الشكلية

يوضح الفيديو مقايسة الالتصاق بالمرحلة الصلبة لتقييم تكوين الأغشية الحيوية. في صفيحة متعددة الآبار ، تلتصق البكتيريا الموجودة في الوسائط المكملة بالملح الصفراوي بالأسطح الصلبة ، وتشكل أغشية حيوية ، وهو ما يؤكده قياس الألوان من خلال تلطيخ البنفسج البلوري ومعالجة الإيثانول.

اختبار الالتصاق بالمرحلة الصلبة لتقييم تكوين الأغشية الحيوية

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي المتزامن والمقارنة بين ثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. تتضمن المنهجية استخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، وبرامج التحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، وبرامج التحليل الإحصائي.

الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية

تقدم هذه الدراسة تطوير منهجيات قابلة للتكرار لدراسة مثبطات الأغشية الحيوية وتأثيراتها على تعدد الخلايا Bacillus subtilis.

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لزراعة وتحليل الأغشية الحيوية البكتيرية على خيوط فطرية بواسطة المجهر متحد البؤر والإلكترون نوعيا.

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

يصف لنا التثبيت وتضمين البارافين وتقنيات تقطيع رقيقة للأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. في إعداد العينات، يمكن تصور أنماط التعبير محيطة ومراسل بيوفيلم بالفحص المجهري.

تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري

يصف هذا البروتوكول تحضير اللقاح ، والقياس الكمي للغشاء الحيوي على ألواح العيار الدقيق باستخدام صبغة البنفسج البلوري ، والعدد القابل للتطبيق في الأغشية الحيوية ، وتصور الأغشية الحيوية للراكدة.

القياس الكمي وتقييم الجدوى واستراتيجيات التصور للأغشية الحيوية الراكدة

يقدم هذا البروتوكول سير عمل معياري بنظام BSL-2 يجمع بين اختبارات الكتلة الحيوية البنفسجية البلورية، حركية التباين الطوري بالتايم لابس، رسم خرائط ثلاثية الأبعاد/المصفوفة الكونفوكلي، البنية الفائقة لSEM، ووحدة عدوى الهامستر في الجسم لزراعة وقياس وتوصيف ودراسة الدور الوظيفي لأغشية ليبتوسبيرا الحيوية، مما يمكن من التقييم الموحد للطفرات والتدخلات المضادة للأغشية الحيوية عبر المختبرات.

سير عمل معياري للتحليل الكمي والهيكلي والوظيفي لأفلام ليبتوسبيرا الحيوية

تعلم طريقة شبه كميّة لدراسة تكوين البيوفيلم عبر مراقبة تطور المستعمرات المتجعدة باستخدام المجهر المكشوف. تتيح هذه التقنية للباحثين مقارنة السلالات البكتيرية المختلفة.

مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة

استكشف المزيد من الفيديوهات