نموذج الفأر من MCAO داخل اللمعة: الدماغي التقييم عائق من قبل تلوين البنفسج الكريزيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو محاكاة السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران. أولاً، يتم ربط الشريان السباتي المشترك مؤقتاً، بينما يتم ربط الشريان السباتي الخارجي بشكل دائم في أبعد نقطة ممكنة. ثم يتم وضع غرزة مؤقتة أخرى مشدودة قليلاً على الشريان السباتي الخارجي فوق نقطة التفرع.

تتمثل الخطوة الثانية في تثبيت الشريان السباتي الداخلي باستخدام ملاقط ذات مفعول عكسي لتجنب حدوث نزيف. بعد ذلك، يتم قطع الشريان السباتي الخارجي (ECA) بين الرباطين الدائم والمؤقت. ثم يتم إدخال خيط أحادي الشعيرة مغلف بالسيليكون في الشريان السباتي الخارجي (ECA).

بعد ذلك، يتم عكس اتجاه الشريان السباتي الخارجي (ECA) لإدخال الخيط أحادي الشعيرة في الشريان السباتي الداخلي (ICA) حتى يصل إلى قاعدة الشريان المخي المتوسط. وبعد مرور ساعة واحدة، يتم استعادة تدفق الدم عن طريق إزالة الخيط أحادي الشعيرة لمحاكاة استعادة تدفق الدم بعد تحلل الجلطة الخثارية الانصمامية لدى البشر. وفي النهاية، يمكن تقييم العجز العصبي، الذي يعكس نجاح عملية T-M-C-A-O وشدة الاحتشاء، مباشرة بعد إعادة التروية وفي أوقات مختلفة تالية لها.

يُستخدم برنامج Cyan image من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لحساب حجم الاحتشاء في شرائح دماغية ممثلة مصبوغة بـ crestal Violet. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لعملية انسداد الشريان الدماغي الأوسط المؤقت باستخدام تقنية الفتيلة داخل اللمعة في أنها تحاكي السكتة الدماغية الإقفارية لدى المرضى مع استعادة تدفق الدم، كما يتيح تطوير هذا الإجراء في الفئران إمكانية استخدام أدوات الوراثة الموجهة لتحديد دور بروتين مستهدف. وفي نموذج السكتة الدماغية، يتم إجراء انسداد الشريان الدماغي الأوسط المؤقت على ذكور فئران C 57 black six تتراوح أعمارها بين شهرين وثلاثة أشهر وتزن ما بين 22 و 28 جراماً.

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الأخلاقيات الحيوية في IRCM لزيادة إمكانية تكرار نتائج حجم الاحتشاء. نحن نستخدم خيطاً أحادياً من السيليكون بطول 12 ملم ومقاس 6-0 من شركة Doco Corporation، وهو قابل لإعادة الاستخدام. قبل الجراحة بساعتين.

يُحقن الفأر بوبيرنورفينين (buprenorphine) عن طريق الصفاق بجرعة 0.03 milligrams per kilogram. لبدء الإجراء، يتم تخدير الفئران باستخدام 5% isof fluorine والحفاظ على التخدير عند 2.5% ISO fluorine، مع استخدام وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر ثابتة أثناء الجراحة، وتطهير جلد الفأر باستخدام 70% ethanol أو Betadine. بعد ذلك، يتم إجراء شق طولي في منتصف الرقبة ومباعدة الأنسجة الرخوة تحت مجهر ستيريو.

قم بتشريح رقبة الفأر تشريحاً غير حاد لكشف القصبة الهوائية. بعد ذلك، قم بإزاحة العضلات لتحديد موقع الشريان السباتي. ثم قم بتشريح الشريان السباتي الأصلي الأيسر بعناية من الأنسجة المحيطة.

ضع غرزة حريرية مؤقتة مقاس 5-0، مقطعة إلى أجزاء طول كل منها 20 millimeter حول الشريان. احرص على عدم إتلاف العصب المبهم. بعد ذلك، افصل تفرع الشريان السباتي المشترك الداخلي (ICA) والشريان السباتي المشترك الخارجي (ECA)، ثم ضع غرزة دائمة حول الـ ECA في أبعد نقطة ممكنة من المركز (distally).

ثم يتم وضع غرزة مؤقتة أخرى في الشريان السباتي الخارجي (ECA) فوق منطقة التفرع. بعد ذلك، يتم غلق الشريان السباتي الداخلي (ICA) الأيسر باستخدام ملاقط ذات حركة عكسية لتجنب حدوث نزيف. ومرة أخرى، يجب توخي الحذر الشديد لعدم إلحاق الضرر بالعصب المبهم.

قم بعمل ثقب صغير في الشريان السباتي الخارجي (ECA) قبل التفرع إلى الشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي الداخلي (ICA)، وبين الغرز الدائمة والمؤقتة التي وُضعت سابقاً. بعد ذلك، أدخل خيط جراحة أحادي الشعيرة مغطى بالسيليكون بمقاس 6-0 وطول 12 مليمتر في الشريان السباتي الخارجي (ECA)، وقم بقطع الشريان السباتي الخارجي (ECA) تماماً، ثم اقلب الخيط أحادي الشعيرة إلى داخل الشريان السباتي الداخلي (ICA). اربط الغرزة بإحكام لمنع النزيف، ثم قم بإزالة الملقط ذو الفعل العكسي.

بعد ذلك، يتم إدخال الخيط أحادي الشعرة (monofilament) في دائرة ويليس حتى يسد الخيط قاعدة الشريان الدماغي الأوسط (MCA). يتم إدخاله لمسافة تتراوح بين 9 إلى 10 mm تقريباً بعد تفرع الشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي المشترك (CCA). وبشكل عام، سيتوقف الخيط أحادي الشعرة عن الحركة ولن يتمكن من التقدم أكثر من ذلك.

كن حذرًا لضمان عدم اختراق الشريان الحنكي. اربط الغرزة على الشريان السباتي الخارجي (ECA) بإحكام من أجل تثبيت الفتيل في موضعه. الآن أغلق الجلد باستخدام نظام إغلاق الجروح "أوتو كليب" (auto clip).

احقن 1 mL من المحاليل الملحية تحت الجلد وضع الفئران تحت مصباح تدفئة بالأشعة تحت الحمراء خلال فترة ما بعد الانسداد، والتي تبلغ 60 دقيقة. خدر الفئران كما في السابق وأزل المشابك التلقائية (auto clips)، وافتح الغرزة الموجودة على الشريان السباتي الخارجي (ECA) قليلاً للسماح بسحب الخيط أحادي الشعيرة وإعادة تروية الدم. بعد ذلك، اربط الغرزة المؤقتة على الشريان السباتي الخارجي (ECA) بشكل دائم لمنع فقدان الدم.

بعد مرور ساعة واحدة من السكتة الدماغية، اسحب الخيط أحادي الشعيرة واحتفظ به لإعادة استخدامه. بعد ذلك، قم بإزالة الغرزة المؤقتة في الشريان السباتي المشترك (CCA) للسماح بإعادة دوران الدم. أغلق الجرح وتحت الجلد.

احقن ملليلتر واحد آخر من المحلول الملحي في الفئران. وبعد التأكد من استعادة الحيوان لقدرته على الحركة، أعده إلى القفص وضع نصف القفص على وسادة التدفئة للسماح للفئران باختيار بيئتها. وبعد 12 ساعة من الجراحة، تتلقى الفئران جرعة أخرى من البوبرينورفين في جميع العمليات الصورية.

تعتبر جميع الإجراءات متطابقة باستثناء عدم إدخال الخيط أحادي الشعيرة بعد الجراحة. يتم تقييم العجز العصبي لتأكيد نجاح عملية T-M-C-A-O وتحديد درجة كفاءتها من خلال تقييم العجز العصبي لدى الفئران بعد 1 و24 و48 و72 ساعة من التروية، وذلك وفقاً لمقياس من ست نقاط على النحو التالي: صفر يعني طبيعي، وواحد يعني خفيف، مع الدوران مع أو بدون التفاف غير متسق عند رفع الفأر من ذيله، وأكثر من 50% من محاولات الالتفاف تكون باتجاه الجانب المقابل.

تُشير الدرجة اثنان إلى وجود التواء خفيف ومستمر في أكثر من 50% من المحاولات للالتواء نحو الجانب المقابل. وتُشير الدرجة ثلاثة إلى التواء مستمر وقوي وفوري، حيث يحافظ الفأر على وضعية الالتواء لمدة تزيد عن ثانية إلى ثانيتين.

حيث يصل الأنف تقريباً إلى الذيل. وتساوي الدرجة أربعة التواءً شديداً. وبالتقدم نحو حالة التبرميل (barreling) وفقدان منعكس المشي أو الكتابة، تساوي الدرجة خمسة حالة الغيبوبة أو التكدس.

بعد التروية بمحلول PBS، قم بتجميد الأدمغة سريعاً في مادة isopentane وخزنها عند درجة حرارة -80 °C. لاحظ أنه يمكن أيضاً تروية أدمغة الفئران بـ 4% paraformaldehyde اعتماداً على دراسات الكيمياء النسيجية المناعية المخطط لها. بعد ذلك، استخدم جهاز المقطاع المجمد (cryostat) لقطع مقاطع دماغية إكليلية بسمك 17 micron باستخدام 30 شريحة.

ضع مقطعاً واحداً من كل 30 مقطعاً على نفس الشريحة. بعد ذلك، قم بصبغ الشريحتين الأولى والخامسة عشرة بصبغة الكريستال البنفسجية. وللحصول على تقدير أكثر دقة لحجم الإصابة، استخدم نظاماً لتحليل الصور مثل Scion image من NIH لتقييم دلي الآفة، وهي منطقة الاحتشاء التي تظهر باللون الأبيض في نصفي الكرة المخية الأيمن والأيسر.

كرر تحديد الـ D هذا على جميع شرائح الدماغ. احسب حجم المنطقة المصابة (infarct volume) بوحدات اعتبارية، وعبّر عنها كنسبة مئوية من مساحة المنطقة المقابلة غير المصابة لكل مقطع. احتفظ بالشرائح الأخرى عند درجة حرارة 80- درجة مئوية لإجراء دراسات الكيمياء النسيجية المناعية.

يؤكد تقييم الدرجة العصبية نجاح عملية T-M-C-A-O في الفئران التي خضعت للإجراء داخل اللمعة. وكما هو موضح هنا، لوحظ وجود التواء مستمر وقوي ومتوسط، حيث تحافظ الفأرة على وضعية الالتواء لأكثر من ثانية إلى ثانيتين، بحيث يكاد أنفها يصل إلى ذيلها. وفي تجربتنا، أظهرت جميع الفئران التواءً مستمراً خفيفاً على الأقل، وهو ما يتوافق مع درجة عصبية تبلغ 2 طوال فترة الاختبار.

تم إجراء صبغ كريسل البنفسجي (Kressel violet) لتقييم مدى احتشاء الدماغ. بعد عملية T-M-C-A-O، تظهر هنا مقاطع إكليلية نموذجية لدماغ فأر مصبوغة بصبغة كريسل البنفسجية بعد 72 ساعة من إعادة التروية. تظهر منطقة الاحتشاء، وبشكل رئيسي الجسم المخطط والقشرة ومناطق الدماغ المجاورة، والمحددة هنا، باللون الأبيض لأنها لم تُصبغ بصبغة كريسل.

يمثل اللون البنفسجي الموضح هنا حجم الإصابة، وهو الجزء الأبيض من نصف الكرة المخية الأيمن معبراً عنه كنسبة مئوية من المنطقة غير المصابة في نصف الكرة المخية الأيسر المقابل. يمثل حجم الاحتشاء في ذكور الفئران من سلالة C 57 black six بعد السكتة الدماغية الإقفارية حوالي 70% من نصف الكرة المخية غير المصاب. يوفر هذا الإجراء قابلية تكرار قوية للآفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء السكتة الدماغية الإقفارية العابرة في الفئران. بالإضافة إلى ذلك، فإن نهج quiz viol لقياس حجم الدماغ الفعلي يمنحك ميزة كبيرة تتمثل في توفر الكثير من المواد لاختبار المؤشرات ذات الصلة عن طريق الكيمياء المناعية. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجربتك.