عزل وتوصيف الخلايا الجذعية والضامة من الأمعاء ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا المتغصنة المعوية للفأر بسرعة أو الخلايا المتغصنة والضامة من أجل التوصيف الظاهري والوظيفي. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الأنسجة المعوية أولا. الخطوة الثانية هي فصل ظهارة الأمعاء عن Lamin propria.

بعد ذلك ، يتم هضم Lamin Propria المعوي خلال الخطوات النهائية للإجراء. يتم تلطيخ خلايا Lamin propria بالفلورة والأجسام المضادة المترافقة والمسورة لمجموعات خلايا معينة. في النهاية ، يمكن توصيف مجموعات التيار المستمر والبلاعم المعوية وتنقيتها بشكل أكثر دقة للدراسات الوظيفية لتقييم عرض مستضد إنتاج السيتوكين وتنظيم الخلايا المناعية.

لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن سرعة هضم الأنسجة تضمن التعبير الأمثل عن مستضد سطح الخلية ، وقابلية الخلية للحياة ، و / أو الخلوية. بعد القتل الرحيم للفأر وتأكيد الموت عن طريق منعكس قرصة إصبع القدم ، اختبر رش 70٪ من الإيثانول على بطن وصدر. ثم استخدم مقصا لعمل شق أفقي صغير في منتصف البطن وتقشير الجلد لكشف الصفاق.

افتح الصفاق باستخدام المقص بعد القطع في العضلة العاصرة لفصل المعدة عن الأمعاء الدقيقة العلوية واستخدام الملقط لإزالة المساريق. قم بقص الصمام اللفائفي مرة أخرى لتحرير الأمعاء الدقيقة بأكملها من الأمعاء الغليظة. استمر في فصل المساريق عن الأمعاء الغليظة وقم بعمل قطع على حافة الشرج.

استخدم المقص لقطع القولون طولا واستخدم درجة حرارة الغرفة C-M-F-P-B-S لغسل محتويات البراز والمخاط من تجويف الأمعاء. ثم استخدم المقص والملقط لإجراء مجهري. قم بتشريح بقع المحرقة على طول السطح المضاد للمساريقية للأمعاء الدقيقة ، واقطع الأمعاء الدقيقة طوليا.

بعد ذلك ، قم بتنظيف تجويف الأمعاء الدقيقة من محتويات البراز والمخاط بدرجة حرارة أكبر في الغرفة C-M-F-P-B-S. بشكل منفصل ، قم بتقطيع الأمعاء الدقيقة والغليظة إلى قطع بحجم 1.5 سم تقريبا وضع القطع في أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مليلتر تحتوي على 30 مل من C-M-F-H-B-S-S قبل الحرب مع FBS و EDTA ملليمول. ضع كل أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر أفقيا في شاكر مداري يهز الأنابيب بسرعة 250 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، ضع مصفاة سلكية شبكية واحدة فوق دلو نفايات. صب محتويات كل أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر من خلال الشبكة لاستعادة قطع الأمعاء ثم ضعها في أنابيب مخروطية فردية جديدة سعة 50 مليلتر تحتوي على 30 مل من التسخين المسبق C-M-F-H-B-S-S مع FBS مع اثنين من مللي مولار EDTA. أخيرا ، ضع الأنابيب مرة أخرى في شاكر المداري لمدة 20 دقيقة أخرى.

بعد الجولة الثانية من الاهتزاز ، اسكب محتويات كل أنبوب من خلال المصفاة. مرة أخرى ، قم بإزالة الوسائط الزائدة باستخدام منشفة ورقية ، ثم انقل قطع الأمعاء إلى قارب مصل اللبن البلاستيكي الصغير. الجانب الوحيد الأصعب في هذه التقنية هو هضم الأنسجة لضمان النجاح ، ويجب مراعاة جميع المعلمات المختلفة لمدة الهضم وخصائص الكولاجيناز وسلامة الأنسجة وحجم الأنسجة المراد هضمها باستخدام المقص بسرعة.

نقطع القطع المعوية ثم نضيف الأمعاء المفرومة إلى أنبوب مخروطي الشكل 50 ملم يحتوي على 20 مل من محلول الكولاجيناز. ضع الأنبوب المخروطي أفقيا في الخلاط المداري وهضم قطع الأمعاء بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 10 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الآن قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لضمان التفكك الشامل لأي أنسجة معوية متبقية ثم قم بتصفية ملاط الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون مباشرة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

أخيرا ، قم بتعبئة الأنبوب المخروطي باستخدام C-M-F-H-B-S-S مع FBS وقم بالطرد المركزي لمحلول الخلية مرتين لمدة خمس دقائق عند 425 مرة G عند أربع درجات مئوية. ثم اسكب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في الثلج البارد C-M-F-H-B-S-S باستخدام FBS وضع العينات على الجليد. بعد تلطيخ الخلايا للبروتينات السطحية ذات الأهمية.

ابدأ بإنشاء مخطط نقطي باستثناء الخلايا الإيجابية لبقعة الخلية الميتة كما هو موضح هنا. بعد ذلك ، استبعد الأحداث المزدوجة كما هو موضح هنا وهنا. استخدم الآن قنوات التشتت الأمامية والجانبية للبوابة على الخلايا ذات الأهمية ، مع التأكد من استبعاد الحطام.

ثم قم بإنشاء بوابة مخطط نقطي آخر على مستضد CD 45 الموجب و IAB الإيجابي. يؤدي تقديم الخلايا في مخطط نقطي منفصل إلى إنشاء مناطق للتمييز بين مجموعات فرعية محددة من DC والبلاعم. تلتقط منطقة R one الموضحة هنا الخلايا السالبة الباهتة CD 11 C موجبة CD 11 B.

المنطقة R الثانية الخلايا التي لها مستوى مماثل من التعبير السطحي ل CD 11 C مثل الخلايا الموجودة في منطقة R one ، ولكنها تعبر أيضا عن CD 11 B. تحدد مناطق R الثلاث الخلايا التي تكون CD 11 و B موجبة و CD 11 C سالبة باهتة. يمكن تحليل هذه المناطق الثلاث بشكل أكبر لتعبير F four 80 و CD 1 0 3 للتمييز بين مجموعات البلاعم و DC على التوالي. كما هو موضح في هذا المخطط النقطي ، فإن الخلايا السالبة الباهتة CD 11 C موجبة CD 11 B في منطقة R one ستعبر عن مستويات عالية من alpha ein CD 1 0 3 والمستويات المنخفضة من F four 80.

يوضح هذا المخطط النقطي أن الخلايا الإيجابية CD 11 B و CD 11 C في منطقة R الثانية ستتألف من كل من DCS والبلاعم بناء على تعبيرها الثنائي التفرع عن CD 1 و 0 3 و F أربعة 80. أخيرا ، بناء على ملف تعريف النمط الظاهري السلبي F 4 80 و CD 1 0 3 المظهر الظاهري السلبي R ثلاثة ، ستتألف الخلايا المسورة CD 11 B الإيجابية CD 11 C del السالبة من البلاعم ، والعلاقة بين مدة هضم الأنسجة على إجمالي إنتاجية الخلية والتعبير عن CD 11 B و CD 11 C موضحة في الأشكال الستة التالية. ينتج عن الأنسجة المعوية التي يتم هضمها لمدة ثلاث دقائق عددا إجماليا منخفضا من الخلايا مما يؤدي إلى عدد قليل من DCS والضامة المتاحة لتوصيف الأنسجة الهضمية لمدة 11 دقيقة ينتج إنتاجا قويا من الخلايا الحية ، مما ينتج عنه مجموعات من dcs والضامة التي تعبر عن مستويات عالية من CD 11 B و CD 11 C المتميزة ظاهريا.

في المقابل ، ينتج عن الهضم لمدة 50 دقيقة إنتاجية خلوية مماثلة مقارنة بالهضم الأمثل. ومع ذلك ، يصبح تحديد مجموعات الخلايا المختلفة باستخدام CD 11 B و CD 11 C أكثر صعوبة. مع تقل التعبير عن CD 11 C ويزداد عدد الخلايا الميتة.

لذلك عند تحسين معايير هضم أنسجة الأمعاء ، يمكن تحقيق إنتاجية قوية للخلايا بسرعة. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكون العزل السريع للتجمعات المعوية والضامة المعوية للفأر مفيدا لتقييم الخصائص الوظيفية للخلايا المناعية ذات المستضدات السطحية السليمة.