Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن الأنماط المعقدة للتعبير الجيني في بنية دماغية كاملة وسليمة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تروية الحيوان ثم استئصال الدماغ. بعد ذلك، يتم تشريح المخيخ ومعالجته باستخدام بروتوكول صبغ العينات الكاملة.

تتمثل الخطوة النهائية في تصور التعبير الجيني باستخدام تفاعل لوني كيميائي نسيجي. وفي نهاية المطاف، يُستخدم المجهر الضوئي الساطع لتصوير أنماط التعبير الجيني السطحية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الكيمياء النسيجية المناعية لمقاطع الأنسجة، في القدرة على تصور الأنماط المعقدة ثلاثية الأبعاد دون الحاجة إلى إعادة البناء.

يقوم بتقديم هذا الإجراء جوشوا وايت، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. بعد التضحية بالحيوان وإخراج الدماغ من الجمجمة، افصل المخيخ عن بقية الدماغ عن طريق إدخال طرفي ملقط أولاً في منتصف السدتين العلوية والسفلية. ثم باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط، قم بفصل السدتين والقشرة الدماغية ببطء عن المخيخ.

قم بتوجيه المخيخ بحيث يكون الجانب الأمامي مواجهاً للأسفل وجذع الدماغ موجهاً للأعلى. الآن، أدخل الملقط في البطين الرابع بين جذع الدماغ والفصص التاسعة والعاشرة من المخيخ. اقطع السويقات عن طريق الضغط بالملقط على كلا الجانبين، ثم ارفع المخيخ برفق بعيداً عن جذع الدماغ.

قم بإجراء التثبيت اللاحق للمخيخ عن طريق الغمر في 4%paraldehyde عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة كحد أدنى. يمكن تخزين المخيخ في 4%paraldehyde لفترة زمنية ممتدة أثناء العمل داخل خزانة استخلاص الأدخنة. صب محلول paraldehyde بلطف واستبدله بمثبت كثيف.

ضع الأنبوبة التي تحتوي على المخيخ ومحلول التثبيت على جهاز هزاز (mutator) وقم بهزه بلطف لمدة تتراوح من ست إلى ثماني ساعات. بعد انقضاء وقت الحضانة، قم بسكب مادة التثبيت الكثيفة واستبدلها بمبيض كثيف. حضّن المخيخ في هذا المحلول طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C مع الهز في اليوم التالي.

استبدل المحلول الموجود في الأنبوب بميثانول 100%. ضع الأنبوب على جهاز الهزاز ورجّه بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد انقضاء وقت الحضنة، استبدل المحلول بميثانول 100% جديد وكرر عملية الحضنة لضمان تجفيف المخيخ.

الآن، قم بإجراء عملية التجميد والإذابة للنسيج في ميثانول 100% عن طريق وضع الأنبوب في وعاء يحتوي على ثلج جاف والتجميد لمدة 30 دقيقة. بعد مرور هذا الوقت، استخدم الملقط لإخراج الأنبوب من الثلج الجاف ثم وضعه على سطح طاولة المختبر للإذابة لمدة 15 دقيقة. كرر إجراء التجميد والإذابة أربع مرات على الأقل لتعزيز تغلغل محاليل الصبغ.

بعد عملية الإذابة النهائية، ضع الأنبوب في مجمد بدرجة حرارة -80 °C طوال الليل. يمكن تخزين الأنسجة لفترات طويلة عند درجة حرارة -80 °C، إما مباشرة قبل خطوات التجميد والإذابة أو بعدها. وخلاف ذلك، يجب الاستمرار في تنفيذ البروتوكول.

في اليوم التالي، يتم إعادة ترطيب المخيخ عن طريق الغمر مع الهز في 50%methanol و50%PBS، ثم 15%methanol و85%PBS، وأخيراً 100%PBS لمدة تتراوح من 60 إلى 90 دقيقة لكل مرحلة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، وبالنسبة لأنسجة المخيخ من الفئران البالغة، يتم إخضاع النسيج للهضم الإنزيمي باستخدام 10 micrograms per milliliter من proteinase K في PBS لمدة تتراوح من دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهز.

خطوة الهضم هذه ليست ضرورية للمخيخ في الفئران التي تبلغ من العمر 5 أسابيع أو أقل. بعد الهضم، قم بسكب proteinase K فوراً واغسل المخيخ في PB S ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة لمنع الهضم المفرط. بعد الغسلة الأخيرة، استبدل المحلول بـ P-B-S-M-T و ROCK طوال الليل في درجة حرارة أربع درجات Celsius لحجب الأنسجة في اليوم التالي.

قم بتفريغ محلول الحجب P-B-S-M-T واحضن النسيج في الجسم المضاد الأولي المخفف في P-B-S-M-T، مع إضافة 5%DMSO لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع التحريك المستمر. بعد انقضاء فترة الحضن، اغسل المخيخ من مرتين إلى ثلاث مرات، لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات في كل مرة، باستخدام P-B-S-M-T عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع التحريك المستمر لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة.

بعد ذلك، يتم تحضين النسيج في الأجسام المضادة الثانوية في محلول P-B-S-M-T مع 5% DMSO عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم غسل المخيخ في P-B-S-M-T مع الهز كما سبق. ثم يتم إجراء غسلة نهائية في PBT لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين مع الهز عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

تزيل هذه الخطوة الحليب الزائد وتعزز وضوح الصبغ. أخيراً، قم بتحضين النسيج في محلول DAB. ومن الأفضل استخدام DAB في الظلام حتى يتم الوصول إلى كثافة الصبغ المثلى.

بما أن الضوء يتسبب في ترسب المادة الملونة، وهو ما قد يزيد من صبغ الخلفية، فيجب أن يكون ناتج التفاعل البني مرئياً بوضوح في غضون 10 دقائق عند الوصول إلى كثافة الصبغ المثلى. أوقف التفاعل بوضع المخيخ في PBS مع 0.4% sodium azide.

يمكن تخزين النسيج لفترة طويلة في هذا المحلول. يجب تصوير الأنسجة المصبوغة بطريقة التحميل الكامل (Whole mount) وهي مغمورة في PBS أو أي وسط آخر يوفر معامل انكسار مثالي. ومن أجل تسهيل وضع العينة الكاملة للتصوير، قم بتحضير هلام أغار بتركيز 1% في طبق بتري بلاستيكي.

بعد ذلك، قم بعمل ثقوب صغيرة في الهلام ثم ثبّت المخيخ داخل هذه الثقوب بالاتجاه المطلوب للتصوير، وقم بتغطية المخيخ بمحلول PBS. أصبح النسيج المصبوغ الآن جاهزاً للتصوير باستخدام المجهر الضوئي. ZEIN two Adelaide c.

يكشف الكيمياء النسيجية المناعية عن وجود أحزمة سهمية في المقاطع المستعرضة للمخيخ. تم تحديد الأجزاء الشفوية الرابعة والخامسة والثالثة في المخطط. ولأغراض التوجيه، يمثل شريط المقياس 500 microns.

الشكل الثاني من ZEIN. يتم التعبير عن البروتين C من Adelaide حصرياً في مجموعات فرعية من أجسام وتغصنات خلايا kinji. في هذه الصورة، يمثل شريط المقياس 150 microns.

تظهر هذه الصورة تحضيراً كاملاً للمخيخ مصبوغاً بـ zein two، Adela C، حيث تظهر خطوط خلايا bikini في صور للمناطق الأمامية والمركزية والخلفية من المخيخ. تشير الأرقام الرومانية إلى فصوص المخيخ. LS هو loist simplex.

يرمز PML إلى الشفوي الجنب متوسط (paramedian labial). ويشير COP إلى المعايير والملصقات الاقترانية. بينما تشير Crust one وcrust two إلى أسماء اثنين من حدود التآكل (LOEs) في نصف الكرة، وتستند تسميات P one وP three إلى تسمية قياسية تُستخدم للإشارة إلى خطوط BR two محددة.

لمزيد من التفاصيل، راجع Sillitoe and Hawks 2002. يمثل شريط المقياس مليمتر واحد. هنا تم إجراء صبغ مناعي للمخيخ باستخدام جسم مضاد لـ cocaine and amphetamine regulated transcript peptide.

يمكن ملاحظة أن هذه الخريطة يتم التعبير عنها في مجموعات فرعية من الألياف المتسلقة التي تمر عبر طبقة الخلايا الهرمية المشار إليها بـ PCL وتنتهي في الطبقة الجزيئية المشار إليها بـ ml. هنا، يمثل شريط المقياس 100 microns.

يمكن ملاحظة أن ألياف الخلايا الموازية الموجبة تبرز في شكل شرائط من شجيرات الخلايا السلة في الطبقة الجزيئية للقشرة المخيخية، بما في ذلك مناطق مثل Oculus المسمى PFL، وOculus المسمى fl. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب جرح المخيخ؛ حيث إن أي تلف خارجي سيؤدي إلى طمس رؤية أنماط الصبغ المعقدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن أنماط معقدة ومثيرة للاهتمام للتعبير الجيني في العصبونات وفي الألياف التي تتصل بها في الدماغ السليم.