قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

الهدف العام من الإجراء التالي هو قياس حركية وتطور دورة الخلية. الخلايا الأولى هي مطاردة النبض المسماة بالرومو أو الديوكسي أو اليوريدين أو BRDU ، والتي يتم دمجه في الحمض النووي للخلية بدلا من الثايميدين. ثم يتم تلطيخ الخلايا بالمناعة بالأجسام المضادة ضد BRDU وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد تلطيخها.

يتم تصنيف الخلايا فقط في المرحلة S حيث تتقدم الخلايا المسماة خلال دورة الخلية إلى G اثنين. تم اكتشافها على أنها تحتوي على أربعة محتوى من NDNA بعد الانقسام. يتم تقليل محتوى الحمض النووي إلى اثنين من N.وبالتالي ، يمكن استخدام تحليل ملامح التألق الناتجة عن قياس التدفق الخلوي لتحديد حركية تقدم دورة الخلية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على البروتوكولات الأخرى التي تستخدم المواد الكيميائية لمزامنة الخلايا هي عدم وجود اضطرابات فسيولوجية قد تؤثر عن غير قصد على آلية انقسام الخلايا. استخدمنا هذه الطريقة لأول مرة عندما أعطتنا محاولاتنا لدراسة معدل تقدم دورة الخلية باستخدام التزامن الكيميائي نتائج غير متوقعة تداخلت مع تحليلنا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية.

على سبيل المثال ، ما هو أساس معدلات النمو التفاضلية بين أنواع الخلايا المختلفة؟ ابدأ هذا البروتوكول عن طريق تسمية الخلايا ب BRDU للقيام بذلك. ابدأ بوضع علامة على لوحة واحدة بحجم 10 سم لكل نقطة زمنية بالإضافة إلى لوحة واحدة لكل عنصر من عناصر التحكم التالية.

BRDU فقط PI فقط BRDU سلبي PI بذرة سلبية لكل لوحة بخمسة في 10 إلى الخامس. تحتضن الخلايا السبع MCF في DMEM المكمل الألواح لمدة 24 إلى 48 ساعة للسماح للخلايا بالتعافي والالتصاق. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 60٪ من الطلاقة ، استبدل الوسط ب DMEM جديد يحتوي على 10 ميكرومولار.

تحتضن BRDU الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية 5٪ CO2 للسماح بدمج BRDU في الحمض النووي. تأكد من ترك طبق واحد دون معالجة ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي أو نقطة زمنية صفرية بعد ساعة واحدة. قم بإزالة وسيط وضع العلامات على النبض واشطف الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS إلى نقاط زمنية تتراوح من ساعتين إلى ثماني ساعات.

أضف وسط النمو الطازج وضعه مرة أخرى في الحاضنة. ثم قم على الفور بحصاد لوحات النقطة الزمنية صفر وساعة واحدة كما هو موضح في القسم التالي. لحصاد الخلايا ، استنشق الوسط واشطف اللوحة.

مرة واحدة مع PBS ، ثم يعين التربسين الخلايا لفصلها عن اللوحة وتجميعها في جهاز طرد مركزي DMEM بمعدل ثلاثة 90 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية. ثم اشطف الخلايا في جهاز طرد مركزي PBS بارد من واحد إلى خمسة ملليلتر بثلاث مرات 90 مرة لمدة خمس دقائق بعد الدوران ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مائة ميكرولتر من الجليد.

PBS بارد يحتوي على 1٪ FBS. يساعد FBS على منع تكتل الخلايا. أحد أهم جوانب هذا الإجراء هو التأكد من أن لديك معلقة خلية واحدة من الخلايا التي تم حصادها.

للحقائق. لتحقيق ذلك ، يمكنك إضافة خلاياك مباشرة إلى الإيثانول قطرة قطرة. هذا أمر بالغ الأهمية بعد ذلك لإصلاح الخلايا ، استخدم الماصة لإضافة الخلايا بالتنقيط إلى خمسة ملليلتر من شفرة الجليد.

70٪ إيثانول في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة أو قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. هذه خطوة مثالية لإيقاف جمع العينات من النقاط الزمنية المختلفة ، ويمكن ترك العينات في الإيثانول لعدة أيام ، مما يسمح بمعالجتها في وقت واحد من خلال ما تبقى من البروتوكول لإجراء تلطيخ BRDU ويوديد البروبيديوم.

قم بإزالة الخلايا من أربع درجات مئوية وقم بطردها بثلاث درجات 90 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، قم بسحب معظم المثبت تاركا حوالي 50 ميكرولترا. ثم دوامة.

لفك الحبيبات لتشويه طبيعة الحمض النووي أثناء الدوامة. أضف ببطء ملليلترا واحدا من اثنين من HCL Triton X 100 العادي بالتنقيط ثم احتضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق بثلاث مرات 90 مرة G بعد ذلك ، تشفط وتتخلص من المادة الطافية.

ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من 0.1 مولي صوديوم تترا بورات. بعد الطرد المركزي ، تستنشق الخلايا مرة أخرى وتتخلص من المادة الطافية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 75 ميكرولتر من تلطيخ BRDU.

امزج الحاضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة ، محميا من الضوء بعد الحضانة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي كما كان من قبل وإعادة تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من PBS تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل مليلتر لكل يوديد بيرديوم. عند تشغيل العينة الموجبة PI من خلال مقياس التدفق الخلوي ، قم بإنشاء مخطط مبعثر أمامي مقابل مخطط مبعثر جانبي لضمان التوزيع المناسب للحجم للخلايا.

يجب رسم كلتا المعلمتين على مقياس خطي. اعرض في نفس الوقت مخططا من FL ثلاثة H مقابل FL اثنين W لعرض تلطيخ PI مقابل عرض نبضة التألق. تستخدم هذه المؤامرة لإنشاء مشية لعزل جزء الخلايا التي يعتقد أنها ضمن نمط التوزيع الطبيعي لدورة الخلية.

بشكل عام ، يتميز نمط التوزيع هذا بمجموعتين من الخلايا من محتوى N وأربعة NDNA من تلطيخ PI يمثلان مرحلتين G واحدة و G من دورة الخلية على التوالي. تمثل سلسلة من الخلايا الموجودة بين هاتين المجموعتين تكرار الحمض النووي المستمر الذي يحدث في المرحلة S من دورة الخلية. قم بإنشاء مخطط يعرض الخلايا المسورة باستخدام FL واحد H أو FITC على مقياس سجل على المحور Y و PI على مقياس خطي على المحور X.

سيتم استخدام هذه المؤامرة لتعيين المعلمات المتبقية باستخدام عناصر التحكم المختلفة وكذلك لجمع البيانات. للتحليل ، ضع عينة وصمة عار PI فقط في منفذ التحميل لمقياس التدفق الخلوي ، واضبط الكسب لوضع G واحد عند حوالي 200 على المحور x. سيكون من الأسهل تصور ذلك في مخطط الرسم البياني لصبغة PI.

بعد ذلك ، ضع عينة BRDU فقط في منفذ التحميل وقم بتشغيلها. اضبط الكسب بحيث تظهر مجموعتان من الخلايا ، BRDU موجبة و BRDU سالبة على المخطط. من الناحية المثالية ، يتم وضع الخلايا السالبة BRDU عند أو أقل من 10 إلى واحد.

عنصر التحكم النهائي هو عينة BDU المائلة PI الساببة. قم بتشغيل عنصر التحكم السلبي هذا للتأكد من أن الخلايا لا تظهر في أي من الأرباع العلوية أو اليمنى. بمجرد تعيين معلمات المخططات المختلفة ، تتم معايرة مقياس التدفق الخلوي وجاهز لمعالجة BRDU و PI. تجمع الخلايا الملطخة البيانات من ما لا يقل عن 10،000 خلية مسورة PI لكل عينة.

ثم باستخدام برنامج مثل FlowJo أو فاكس ديفا، قم بإنشاء مخطط من FITC مقابل PI مع خلايا مسورة على أنها PI موجبة من PI مقابل FL اثنين W. للتمييز بين سكان ركوب الدراجات. بعد ذلك ، قم بإنشاء بوابة ثانية لعزل السكان الإيجابيين ل BRDU.

ثم لتتبع المسار الزمني لتقدم دورة الخلية ، ارسم عدد الخلايا الموجبة BRDU مع محتوى G واحد أو G اثنين كدالة للوقت لمقارنة دورة تقدم الخلية. الحركية بين خطين من خلايا القولون والمستقيم HT 29 و LS 180. تم جمع الخلايا كل ساعة لمدة ثماني ساعات بعد إزالة نبضة A-B-R-D-U.

بمقارنة حركية الملفين الشخصيين ، فإن ظهور قمة G one واضح عند t يساوي أربع ساعات بعد BRDU في خلايا LS 180 مقارنة بالنقطة الزمنية المقابلة لخط خلية HT 29 ، الذي يفتقر إلى هذه الذروة. يشير هذا إلى تقدم دورة الخلية المتسارع خلال المرحلة الثانية من دورة الخلية. في خط خلايا القولون والمستقيم LS 180 لإنشاء ملف تعريف دورة لخط خلايا سرطان الثدي.

تم جمع MC سبع خلايا كل ساعة لمدة ثماني ساعات. بعد إزالة نبض BRDU. ثم تم فرز الخلايا المناعية والخلايا المضادة للحمض النووي بناء على إشارات الفلورسنت الخاصة بها.

كما يتضح من هنا ، تم تدوير سبع خلايا في التليف الكيسي بمعدل أبطأ بكثير من أي من خطي خلايا القولون والمستقيم التي تم اختبارها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية السماح لك بوضع العلامات الأيضية للحمض النووي جنبا إلى جنب مع حصاد النقطة الزمنية بتتبع حركية دورة الخلية.