Name: وحيد الطفرات سيت بيسلفيت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: تعلم تحليل مثيلة الحمض النووي في الخلايا الفردية باستخدام تقنية التحويل البيسلفيتي للبويضات. تتيح هذه الطريقة دراسة التنظيم الوراثي في التطور المبكر بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل جامعة ويسترن اونتاريو، وقسم التوليد وأمراض النساء، ومنحة ER06-02-188 من البحوث Ministryof والابتكار، في وقت مبكر جائزة الباحث. وأيدت الاحزاب من قبل برنامج التدريب CIHR في التكاثر، والتنمية في وقت مبكر وتأثير ذلك على الصحة منحة دراسات عليا (REDIH).

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+human+disease%3A+translating+basic+biology+into+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li>
<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+analysis+on+individual+chromosomes%3A+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li>
<li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylation%3A+Bisulphite+Modification+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).</li>
<li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li>
<li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li>
<li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+superovulation%3A+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li>
<li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Yi+Chuan+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li>
<li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Hajj, N. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+bisulfite+%28pyro%29sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هذا الفحص بويضة واحدة تحتوي على العديد من الخطوات مع عدد التي تعتبر بالغة الأهمية وتتطلب رعاية خاصة. الأول هو غسل البويضة. من المهم بشكل خاص لغسل كل بويضة عدة مرات في المتوسط ​​الطازجة يسقط بعد العلاج هيالورونيداز لإزالة الركام وخلايا أكبر عدد ممكن. وعلاوة على ذلك، عند نقل البويضات إلى حل الحمضية tyrode لإزالة الشفافة زونا تأكد المحيطة المتوسط ​​هو واضح من الخلايا الركامية. البويضة غير لزجة جدا بعد إزالة زونا، ويمكن بسهولة أي الخلايا الركامية المحيطة تصبح عالقا إلى البويضة. من الص...

جدول معين من الكواشف والمعدات. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td colspan="4"> مجموعة سيت </td></tr><tr><td> هيالورونيداز </td><td> سيغما </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> الحمضية Tyrode </td><td> سيغما </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> بروتين K </td><td> سيغما </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10٪ IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> تحلل الحل </td></tr><tr><td> تريس 7.5 درجة الحموضة </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> سيغما </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nباهوجان ساماج؛ </td></tr><tr><td> EDTA 8.0 درجة الحموضة </td><td> سيغما </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> اغطية </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> إينفيتروجن </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS تحلل الواق </td></tr><tr><td> الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة </td><td> Bioshop (تريس) سيغما (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10٪ SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> بيسلفيت التحويل </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrogensulfite الصوديوم (بيسلفيت الصوديوم) </td><td> سيغما </td><td> 243973 </td><td>؛ </td></tr><tr><td> هيدروكينون </td><td> سيغما </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> منخفض الانصهار نقطة (LMP) الاغاروز </td><td> سيغما </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> الزيوت المعدنية </td><td> سيغما </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2 متوسط </td><td> سيغما </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO ماء مقطر </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> المعقمة مزدوج المقطر (د د) المياه </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra ميكس بداية ساخنة RTG </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 نانوغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال خميرة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5X رد الفعل GoTaq الأخضر الواق </td><td> المؤيدميجا </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> متداخلة الاشعال الداخلي والخارجي </td><td> سيغما </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> رباط </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T المتجهات سهل </td><td> فيشر العلمية </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA الاستنساخ </td></tr><tr><td> الخلايا المختصة القولونية </td><td> الإنزيم بحوث كورب </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> معدات </td></tr><tr><td> تشريح مجهر </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 درجة مئوية و 90 درجة مئوية الحرارة كتل </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية Waterbaths (42 درجة مئوية لمدة التحولات) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>المهزة </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR آلة </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

علم التخلق يتفرد بها كل الموروثة وتعديلات عكسها على لونين من شأنها أن تغير الجينات إمكانية الوصول، وبالتالي هي الآليات الأساسية لتنظيم النسخ الجيني 1. الحامض النووي هو تعديل اللاجينية التي تعمل في الغالب على أنه علامة القمعية. من خلال إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل على cytosines في dinucleotides الدليل السياسي الشامل، فإنه يمكن توظيف البروتينات القمعية إضافية وتعديلات بسيطة لبدء العمليات التي ينطوي عليها التكثيف لونين وإسكات الجينات 2. الحامض النووي أمر ضروري للتطور الطبيعي لأنه يلعب دورا حاسما في البرمجة التنموية، تمايز الخلايا، وقمع العناصر فيروسات، تعطيل كروموسوم X-والبصمة الجينية. واحدة من أكثر الوسائل قوية لتحليل الحامض النووي هو الطفرات بيسلفيت. بيسلفيت الصوديوم هو المغير الحمض النووي التي deaminates cytosines إلى uracils. بعد التضخيم PCR وseque<html> ncing، تم الكشف عن هذه الأحداث تحويل كما thymines. محمية cytosines ميثليته من نزع الأمين وهكذا تظل كما cytosines، مما يتيح تحديد الحامض النووي على مستوى فردي النوكليوتيدات 3. وقد تقدمت تطوير بيسلفيت فحص الطفرات من تلك التي ذكرت في الأصل 4-6 نحو تلك التي هي أكثر حساسية وقابلية للتكرار 7. وكان واحد تقدم مفتاح تضمين كميات صغيرة من الحمض النووي في حبة الاغاروز، ومن ثم حماية الحمض النووي من معاملة قاسية بيسلفيت 8. إلى أن يتم تنفيذ هذا التحليل مثيلة تمكين على برك من البويضات والأجنة في مرحلة الكيسة 9. والطفرات بيسلفيت الأكثر تطورا حتى الآن هو بروتوكول للأجنة في مرحلة الكيسة فرد 10. ومع ذلك، منذ blastocysts يكون على الخلايا متوسط ​​64 (التي تحتوي على 120-720 خريج من الحمض النووي الجيني)، وهذا الأسلوب غير فعال للدراسات مثيلة في البويضات أو الأجنة الفردية الانقسام المرحلة. خيمة &quot;&gt; أخذ القرائن من تضمين الاغاروز كميات الحمض النووي بما في ذلك البويضات الدقيقة 11، هنا نقدم وسيلة يتم من خلالها مباشرة جزءا لا يتجزأ من البويضات في الاغاروز وتحلل حبة حل استرجاع التالية فورا وإزالة الشفافة زونا من البويضة، وهذا يتيح لنا تجاوز التحديات الرئيسيان من بويضة واحدة الطفرات بيسلفيت: حماية كمية ضئيلة من الحمض النووي من تدهور، وفقدان لاحق خلال خطوات عديدة بروتوكول الأهم من ذلك، كما يتم الحصول على البيانات من البويضات واحد، هو القضاء مسألة التحيز PCR داخل حمامات وعلاوة على ذلك. ، غير مقصود تلوث الخلية الركامية قابلا للاكتشاف من قبل هذه الطريقة منذ يجوز استبعاد أي عينة مع نمط مثلأيشن واحد أو أكثر من تحليل 12. هذا البروتوكول يوفر طريقة أفضل للتحليل ناجحة وقابلة للتكرار من الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية، ويعتبر مثاليا لالبويضات الفردية، وكذلك الأجنة في مرحلة الانقسام.

الطفرات بيسلفيت هو معيار الذهب لتحليل الحامض النووي. لدينا بروتوكول تعديل يسمح لتحليل الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية والتي صممت خصيصا لالبويضات الفردية. ويمكن أيضا استخدامه لانشقاق في مرحلة الأجنة.

تشمل علم فوق الجينات (Epigenetics) جميع التعديلات المورثة والقابلة للعكس التي تطرأ على الكروماتين وتغير من إمكانية الوصول إلى الجينات، وبالتالي فهي تمثل الآليات الأساسية لـ ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل ميثيلة الحمض النووي DNA في بويضة واحدة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة خلايا الكمulus وsoap palita من البويضات التي تم جمعها. والخطوة الثانية هي غمر البويضة في محلول aros lysis بنسبة اثنين إلى واحد لحماية الكمية الضئيلة من الـ DNA من الفقد أو التحلل.بعد ذلك، يتم إجراء طفرات ثنائي الكبريتيت، يليه التضخيم من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. وتتمثل الخطوة النهائية في ربط واستنساخ ناتج تفاعل PCR. ثم يتم اختيار المستنسخات وتضخيمها بواسطة تفاعل PCR وإرسالها للتسلسل.في النهاية، يُستخدم التطفير بالبيسلفيت والتسلسل لإظهار مثيلة DNA عند سيتوزين فوسفات جوانين، أو ثنائيات النوكليوتيد CPG في منطقة معنية داخل بويضة واحدة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التطفير بالبيسلفيت لأعداد كبيرة من الخلايا، في إمكانية الحصول على البيانات من بويضة واحدة دون الحاجة إلى تجميع الخلايا، وتجنب انحياز PCR والتلوث الخلوي الكيميائي. في يوم جمع البويضات، قم بتحضير المحاليل المدرجة في البروتوكول المكتوب حديثاً، وعند تحضير المحاليل، قلل من احتمالية تلوث DNA عن طريق تغيير القفازات بشكل متكرر واستخدام رؤوس ماصات ذات مرشحات، كما حافظ على إمالة الأنابيب بعيداً عند فتحها وأغلق جميع الأنابيب عندما لا تكون قيد الاستخدام.ابدأ عملية جمع البويضات (OSI) بوضع قنوات فالوب المستأصلة من الفأر في وسط M2، ثم اسحب البكرة M لاستخراج معقد الخلايا التاجية. بعد ذلك، افصل البويضات عن معقد الخلايا التاجية باستخدام محلول هيالورونيداز بتركيز 0.3 mg/mL في قطرة بحجم 30 µL من وسط M2. حافظ على البويضات في المحلول فقط للفترة الزمنية اللازمة لإزالة الخلايا التاجية، حيث إن التعرض الطويل قد يؤدي إلى تلفها.اغسل البويضات في قطرات بحجم 30 µL من وسط M two عن طريق نقل البويضات من قطرة إلى أخرى، مع إزالة خلايا الكتلة المحيطة (cumulus cells) بشكل دوري لإجراء ثلاث غسلات إجمالية. قم بإزالة Z of LUCITA باستخدام محلول tpyro الحمضي.ضع البويضات أولاً في قطرة واحدة بحجم 30 µL من المحلول، ثم انقلها إلى قطرة أخرى بحجم 30 µL؛ وذلك لأن أي وسط يتم نقله معها سيؤدي إلى تخفيف الحمض وتقليل كفاءته. أبقِ الخلايا في المحلول فقط للمدة الزمنية اللازمة لإزالة المنطقة الشفافة، حيث أن التعرض الطويل قد يؤدي إلى إتلافها.بعد إزالة المنطقة الشفافة، اغسل الخلايا مرة أخرى في قطرة بحجم 30 µL من وسط M2؛ ولإجراء عملية التضمين في Agarose، ضع أولاً محلول التحلل على كتلة تسخين عند درجة حرارة 70 °C. أضف Agarose منخفض درجة الانصهار (LMP Agarose) المسخن مسبقاً إلى محلول التحلل، بحيث تكون النسبة 2:1 من Agarose إلى محلول التحلل. ثم ضع بويضة واحدة على شريحة زجاجية نظيفة في كمية قليلة من وسط M2.الخطوة التالية هي غمر الخلية الواحدة في محلول Agros والتحلل. يجب القيام بذلك بسرعة لأن Agros يتصلب في درجات حرارة أقل من 65 °C. اسحب 10 µL من محلول Agros للتحلل باستخدام رأس ماصة تحت المجهر.قم بطرد حوالي 1 µL أو أقل من محلول تحلل agros برفق على الشريحة الزجاجية، مع السماح له بالاختلاط بالوسط الغذائي الأدنى. اسحب البويضة برفق داخل طرف الماصة. ثم ضع كامل الـ 10 µL في أنبوبة einor تحتوي على 300 µL من الزيت المعدني بحيث تتخذ القطرة الناتجة شكلاً كروياً.يُحضن الأنبوب على الثلج لمدة 10 دقائق لإجراء عملية التحلل. تُزال 300 µL من الزيت المعدني ويُضاف 500 µL من منظم تحلل SDS. تُحضن العينة طوال الليل في حمام مائي مضبوط على 50 °C في اليوم الثاني.قم بتحضير محاليل الطفرات الكبريتيدية الثنائية طازجة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ابدأ عملية إحداث الطفرات بإزالة 500 microliters من منظم ليزيس SDS بالكامل. ضع في اعتبارك أن أي كمية متبقية من منظم الليزيس ستؤدي إلى تخفيف الـ agros عند تسخينه، مما يجعل الخرزة أكثر عرضة للذوبان في الخطوات اللاحقة.بعد الإزالة الكاملة لمحلول التحلل، أضف 300 µL من الزيت المعدني. يتم تحضين العينة لمدة دقيقتين ونصف على كتلة تسخين بدرجة حرارة 90 °C. استخدم أداة لتحريك أو رج العينة، أو لبسطها، أو لتقليب درجة الحرارة.بعد مرور دقيقتين ونصف، يتم تحضين العينة على الثلج لمدة 10 دقائق. ولإجراء عملية المسخ، يتم إزالة الزيت المعدني وإضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 مولار إلى الأنبوب، ثم يُنقر على الأنبوب ويُقلب من خمس إلى ست مرات.قم بحضن العينة لمدة 15 دقيقة. في حمام مائي مضبوط على 37 °C مع التقليب كل ثلاث إلى أربع دقائق، يجب أن تطفو الخرزة في هيدروكسيد الصوديوم. لاحظ أن الخرزة لم تعد في قاع الأنبوب.لإجراء المعالجة بالسلفيت، قم أولاً بتدوير الأنبوب برفق بعد إزالة هيدروكسيد الصوديوم. أضف 300 µL من الزيت المعدني و 500 µL من محلول BIS sulfite. احرص على تجنب التعرض للضوء واترك الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 50 °C لمدة ثلاث ساعات ونصف.قم الآن بإجراء عملية إزالة التسمم. أولاً، حضّن العينة على الثلج لمدة ثلاث دقائق قبل إزالة الزيت المعدني ومحلول BIS sulfite. بعد عملية طرد مركزي خفيفة، أضف 1 mL من sodium hydroxide بتركيز 0.3 M، ثم قم بنقر الأنبوبة وقلبها من خمس إلى ست مرات.قم بتحضين العينة لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C مع التقليب كل ثلاث إلى أربع دقائق؛ ومجدداً، يجب أن تطفو الحبيبات في هيدروكسيد الصوديوم قبل البدء في عملية PCR. اغسل العينات عن طريق إجراء طرد مركزي خفيف أولاً.بعد ذلك، قم بإزالة هيدروكسيد الصوديوم وأضف 1 mL من 1x TE بـ pH 7.5. رجّ المزيج لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد عملية طرد مركزي ثانية خفيفة، قم بإزالة 1x TE.كرر عملية الغسل هذه مرتين. ثم أضف 1 mL من الماء المقطر مرتين والمعقم بجهاز الأوتوكلاف. رج الأنبوب لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بالطرد المركزي برفق للمرة الثالثة وتخلص من الماء.كرر عملية الغسل بالماء المقطر مرتين. وأخيراً، قم بإزالة جميع السوائل الطافية، مع ترك حبيبة aros فقط. تحقق من أن pH السائل الطافي هو 5.0.إذا كان السائل الطافي لا يزال قاعدياً جداً، اغسل الحبيبات مرة أخرى بماء مقطر مزدوج. وفي هذه الأثناء، أضف مزيج الـ PCR للجولة الأولى إلى أنبوب الـ PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. حرك الـ solid agro speed إلى حافة أنبوب einor.بعد ذلك، قم بنقل agro speed بعناية إلى أنبوب PCR، وسخنه عند 70 °C لمدة دقيقة واحدة مع الخلط، ثم ابدأ بالتضخيم كما هو مقترح في البروتوكول المكتوب. وعقب جولة التضخيم الأولى، قم بتحضير تفاعل PCR للجولة الثانية باستخدام 5 µL من ناتج الجولة الأولى كقالب. تأكد من وضع الماصة أسفل طبقة الزيت المعدني.باشر بإجراء الجولة الثانية من التضخيم كما هو موضح في النص كاختبار تشخيصي. يمكن قطع عينات الجولة الثانية باستخدام إنزيم قطع متخصص في الميثيلية أو السلالة، ثم يتم إجراء الرحلان الكهربائي لنواتج الهضم على هلام أكريلاميد بتركيز 8%acrylamide. تمثل أي نطاقات غير متجانسة ناتجة وجود أكثر من تسلسل واحد؛ ولاستنساخ ناتج الجولة الثانية، يتم ربطه في الناقل وإجراء استنساخ TA كما هو موضح في المخطوطة المرافقة لهذا الفيديو. بعد استنساخ TA، يتم صب جميع خليط التفاعل على طبق agar وLB، مُدعم بـ ampicillin وex gal وIPTG، ويُحضن الطبق عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل.ثم أضف المزيج الرئيسي لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للمستعمرات إلى أنبوب PCR كما هو مدرج في البروتوكول المكتوب. التقط مستعمرة بكتيرية بيضاء من الطبق باستخدام طرف ماصة وقم بتحريكها داخل 35 µL من المزيج الرئيسي لتفاعل PCR للمستعمرات في أنبوب PCR. تابع تضخيم المعلق كما هو موضح في النص التالي لتضخيم PCR، ثم قم بإجراء الفصل الكهربائي لـ 4 µL من ناتج PCR على هلام AGROS بتركيز 1.5%.وأخيراً، يتم إرسال حوالي 30 µL من ناتج الـ PCR لتسلسل خمسة تفاعلات PCR للمستعمرات لكل خلية. وبمجرد الحصول على نتائج التسلسل، يمكن قراءة أنماط الميثيلة؛ حيث إن أي سيتوزين جوانين أصلي ظل كما هو كان ميثيلياً. وعلى العكس من ذلك، فإن أي سيتوزين جوانين أصلي تحول الآن إلى ثايمين جوانين كان غير ميثيلي بعد تضخيم الـ PCR المتداخل باستخدام بادئات محولة بالبيسلفيت.من الممكن تأكيد نجاح عملية التحويل من خلال معاينة الحجم الصحيح للقطعة على هلام الأجاروز في كل طور استوائي فردي. تمثل كل بويضة أليلاً أبوياً واحداً، وبناءً على ذلك، فإنها تمتلك نظرياً نمط مثيلة بصمة واحدة. ويمكن اختبار نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الجولة الثانية للتحقق من عدم وجود تلوث غير مقصود.يمكن استخدام إنزيم قطع حساس لمثيلة DNA لهضم ناتج جولة PCR الثانية لتقييم ما إذا كان يحتوي على أليل مُمَثيَل أو غير مُمَثيَل. هنا، يتم قطع السيتوزين المُمَثيَل الموجود ضمن تسلسل التعرف الخاص بالإنزيم. بينما لا يتم التعرف على السيتوزين غير المُمَثيَل الذي تحول إلى ثايمين بواسطة الإنزيم ويظل غير مقطوع؛ لذا يجب التخلص من أي عينة بويضة في الطور الاستقلابي الثاني تحتوي على كل من الأليلات المُمَثيَلة وغير المُمَثيَلة، لأن ذلك يشير إلى تلوث بخلايا محيطة أو وجود الجسم القطبي بعد عملية الربط والتحول.يمكن تصور نجاح تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمستعمرات على هلام AROS للتأكد من إرسال العينات التي تحتوي على الحجم الصحيح للمنتج إلى التسلسل. في هذا المثال، يبلغ حجم القطعة المضخمة المتوقع بعد الربط 56 base pairs. وهنا، يظهر أن المستنسخ الخامس لديه حجم قطعة مضخمة غير صحيح، وبالتالي لا ينبغي إرساله للتسلسل.يجب أن ينتج عن تسلسل خمس مستنسخات فردية من بويضة في الطور الاستوائي الثاني خمسة أنماط مثيلة متطابقة ومعدلات تحويل غير CPG متطابقة. ويجب التخلص من أي عينات تحتوي على أكثر من نمط واحد. وبما أن البويضات المتبايضة في الطور الاستوائي الثاني تحتوي على نسختين من الكروموسومات أو جسم قطبي متصل، فهناك احتمالية للحصول على نمطي تسلسل متشابهين.يجب استبعاد البيانات من أي خلايا تظهر أنماط ميثيلية متباينة للغاية. وبما أنه لا يمكن استبعاد تلوث الخلايا الركامية عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، فمن المهم تذكر غسل البويضات عدة مرات في وسط طازج أولاً، بعد المعالجة بـ HI IDE لإزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا الركامية. ثانياً، سيتصلب agarose ذو درجة الانصهار المنخفضة عند درجات حرارة أقل من 65 °C، لذا يجب العمل بدقة ولكن بسرعة.وفي الختام، فإن بيسلفات الصوديوم والهيدروكينون حساسان للضوء، لذا يجب تغليف أنابيب التفاعل والمحاليل بورق القصدير.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

البويضات عرضة لعدم توازن الصبغيات بسبب أخطاء في العزل الصبغي خلال نضوج الانتصافي. البيض يمكن أن تسبب العقم مختل الصيغة الصبغية ، والإجهاض ، أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. هنا ، نحن تصف طرق لإدخال المواد المختارة في البويضات وأساليب لدراسة وتقييم النضج الانتصافي الصيغة الصبغية.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل المرتبطة MTOC في البويضات.

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير.

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

المتغيرات الجينية المرتبطة بأمراض الإنسان تبدأ لتصبح كشف، تزداد أهمية وضع نظم لتقييم سرعة الأهمية البيولوجية لتلك المتغيرات التي تم تحديدها. ويصف هذا البروتوكول الأساليب لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الإناث الأول باستخدام بويضات الماوس.

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

الخطأ في فصل الكروموسومات هو سمة شائعة في البويضات. لذلك ، فإن دراسة نقطة تفتيش تجميع المغزل تعطي أدلة مهمة حول الآليات اللازمة لإنتاج بيض صحي. يصف البروتوكول الحالي ثلاثة مقايسات تكميلية لتقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفئران.

تقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفأر

تقدم هذه المقالة طريقتين تعتمدان على التهجين الفلوري في الموقع لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.

استكشاف انحرافات كروموسومات X في خلايا المبيض باستخدام التهجين الفلوري في الموقع

في هذا البروتوكول ، تم تحسين طريقة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) وعزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا (INTACT) للاستجواب المزدوج لنسخة المبيض الخاصة بالخلية و epigenome باستخدام نموذج الماوس NuTRAP الذي تم عبوره إلى خط الماوس Cyp17a1-Cre.

استجواب مزدوج خاص بالخلية ل Epigenome المبيض للفأر و Transcriptome

يعد الحفاظ على سلامة جينوم البويضة أمرا ضروريا لضمان الإخلاص الجيني في الجنين الناتج. هنا ، نقدم بروتوكولا دقيقا للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا الجرثومية الأنثوية للثدييات.

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

تؤسس هذه الورقة خط أنابيب لمعلقات عالية الجودة للخلية المفردة والنوى لأجنة الفئران المعدة لتسلسل الخلايا المفردة والنوى.

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

الأخطاء الانتصافية في نقاط الاشتباك العصبي وإعادة التركيب شائعة في بويضات الثدييات. يعد التحليل الدقيق للبروتينات المشاركة في هذه العمليات أمرا ضروريا لفهم كيف ولماذا يحدث تكوين البويضات بشكل خاطئ في كثير من الأحيان. تسمح التقنيات المعروضة هنا بمراقبة شاملة لإعادة التركيب والمشابك لتقييم جودة البويضات في الفئران.

تحضير انتشار الكروموسوم الانتصافي من بويضات الفئران لتقييم التشابك وإعادة التركيب

تعلم تحليل مثيلة الحمض النووي في الخلايا الفردية باستخدام تقنية التحويل البيسلفيتي للبويضات. تتيح هذه الطريقة دراسة التنظيم الوراثي في التطور المبكر بدقة عالية.

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

استكشف المزيد من الفيديوهات