وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل مثيلة الحمض النووي في بويضة واحدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الخلايا الركامية والصابون من البويضات المجمعة. الخطوة الثانية هي تضمين البويضة في محلول تحلل اثنين إلى واحد لحماية الكمية الدقيقة من الحمض النووي من الضياع أو التدهور.

بعد ذلك ، يتم إجراء الطفرات ثنائية الكبريتيت ، متبوعا بالتضخيم من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. الخطوة الأخيرة هي ربط واستنساخ منتج PCR. ثم يتم اختيار المستنسخة وتضخيمها وإرسالها للتسلسل.

في النهاية ، يتم استخدام الطفرات والتسلسل ثنائي الكبريتيت لإظهار مثيلة الحمض النووي في غينيا فوسفات السيتوزين ، أو ثنائي النوكليوتيدات CPG في منطقة ذات أهمية في بويضة واحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الطفرات ثنائية الكبريتيت لأعداد الخلايا الكبيرة ، هي أنه يمكن الحصول على البيانات من بويضة واحدة دون تجميع تحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل للخلايا وتلوث الخلايا الكيميائية. في يوم جمع البويضات ، قم بإعداد الحلول المدرجة في البروتوكول المكتوب حديثا عند صنع الحلول التي تقلل من فرصة تلوث الحمض النووي عن طريق تغيير القفازات في كثير من الأحيان واستخدام أطراف المرشح أيضا إبقاء الأنابيب بزاوية بعيدا عند الفتح وإعادة تلخيص جميع الأنابيب عندما لا تكون قيد الاستخدام.

ابدأ في جمع OSI عن طريق وضع جسور المبيضات المقطعة في M اثنين من الوسائط وتمزيق البكرة M لاستخراج مركب الخلايا الركامية. ثم افصل الخلايا عن مركب الخلايا الركامية باستخدام 0.3 ملليغرام لكل مليلتر من محلول الهيالورونيداز في قطرة 30 ميكرولتر من M اثنين من الوسط. احتفظ بالخلايا في المحلول فقط طالما استغرق الأمر لإزالة الخلايا الركامية لأن التعرض الطويل قد يتلفها.

اغسل البويضات في 30 قطرة ميكرولتر من وسائط M two عن طريق نقل البويضات من قطرة إلى أخرى. إزالة الخلايا الركامية بشكل دوري لما مجموعه ثلاث غسلات. قم بإزالة Z من LUCITA باستخدام محلول تيرو حمضي.

ضع البويضات أولا في قطرة واحدة من المحلول سعة 30 ميكرولتر ، ثم انقلها إلى قطرة أخرى بحجم 30 ميكرولتر. نظرا لأن أي وسائط محمولة على طول ستعمل على تخفيف الحمض وتقليل كفاءته. احتفظ بالخلايا في المحلول فقط طالما استغرق الأمر لإزالة المنطقة لأن التعرض الطويل قد يتلفها.

بعد إزالة المنطقة ، اغسل الصيولات مرة أخرى في قطرة 30 ميكرولتر من M اثنين من الوسائط لإجراء تضمين agros أولا وضع محلول التحلل على كتلة حرارية 70 درجة مئوية. أضف نقطة الانصهار المنخفضة المسخنة مسبقا ، أو LMP Agros إلى محلول التحلل ، مما ينتج عنه محلول AGROS إلى واحد للتحلل. ثم ضع بويضة واحدة على شريحة زجاجية نظيفة في الحد الأدنى من وسائط M اثنين.

الخطوة التالية هي تضمين الخلية المفردة في محلول Agros والتحلل. يجب أن يتم ذلك بسرعة حيث سيتصلب الغرو عند درجات حرارة أقل من 65 درجة مئوية. خذ 10 ميكرولترات من محلول تحلل Agros في طرف ماصة تحت المجهر.

قم بطرد حوالي ميكرولتر واحد أو أقل من محلول تحلل agros برفق على الشريحة الزجاجية ، مما يسمح لها بالاختلاط مع الحد الأدنى من الوسائط. التقط البويضة برفق في طرف الماصة. ثم ضع كل 10 ميكرولتر في أنبوب einor مع 300 ميكرولتر من الزيت المعدني بحيث تأخذ الخرزة الناتجة شكلا كرويا.

احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق لإجراء التحلل. قم بإزالة 300 ميكرولتر من الزيت المعدني وأضف 500 ميكرولتر من مخزن تحلل SDS. احتضن العينة طوال الليل في حمام مائي تم ضبطه على 50 درجة مئوية في اليوم الثاني.

قم بإعداد محاليل الطفرات ثنائية الكبريتيد طازجة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ابدأ الطفرات عن طريق إزالة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل SDS بالكامل. ضع في اعتبارك أن أي مخزن مؤقت متبقي للتحلل سيخفف من agros عند تسخينه وستكون الخرزة أكثر عرضة للذوبان في الخطوات اللاحقة.

بعد الإزالة الكاملة للمخزن المؤقت للتحلل ، أضف 300 ميكرولتر من الزيت المعدني. احتضان العينة لمدة دقيقتين ونصف على كتلة حرارية 90 درجة مئوية. خذ قيراط لخلط درجة الحرارة أو تقليبها أو تمديدها أو تذبذبها.

بعد دقيقتين ونصف. احتضان العينة على الجليد لمدة 10 دقائق. لإجراء التمسخ ، قم بإزالة الزيت المعدني وأضف ملليلتر واحد من 0.1 مولار هيدروكسيد الصوديوم إلى نفض الغبار عن الأنبوب وقم بقلب الأنبوب من خمس إلى ست مرات.

احتضان العينة لمدة 15 دقيقة. في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية مقلوبة كل ثلاث إلى أربع دقائق ، يجب أن تطفو الخرزة في هيدروكسيد الصوديوم. لاحظ أن الخرزة لم تعد في قاع الأنبوب.

لإجراء العلاج بالكبريتيت ، قم أولا بتدوير الأنبوب برفق بعد إزالة هيدروكسيد الصوديوم. أضف 300 ميكرولتر من الزيت المعدني و 500 ميكرولتر من محلول كبريتيت BIS. احرص على تجنب التعرض للضوء واحتضان الأنبوب لمدة ثلاث ساعات ونصف في حمام مائي 50 درجة مئوية.

الآن قم بإجراء desination. قم أولا باحتضان العينة على الثلج لمدة ثلاث دقائق قبل إزالة الزيت المعدني ومحلول كبريتيت BIS. بعد الدوران اللطيف ، أضف ملليلترا واحدا من 0.3 مولا من هيدروكسيد الصوديوم واقلب الأنبوب من خمس إلى ست مرات.

احتضان العينة لمدة 15 دقيقة. في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ينقلب كل ثلاث إلى أربع دقائق ، مرة أخرى ، يجب أن تطفو الخرزة في هيدروكسيد الصوديوم قبل بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). اغسل العينات عن طريق الدوران برفق أولا.

ثم قم بإزالة هيدروكسيد الصوديوم وأضف ملليلترا واحدا من درجة الحموضة xte 7.5. رج العبوة لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران اللطيف الثاني ، قم بإزالة XTE.

كرر عملية الغسيل هذه مرتين. ثم أضف ملليلتر واحد من الأوتوكلاف والماء المقطر المزدوج. يرج لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ويدور برفق للمرة الثالثة ثم قم بإزالة الماء.

كرر غسل الماء المقطر المزدوج مرتين. أخيرا ، قم بإزالة كل المواد الطافية ، مع ترك حبة aros فقط. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمادة الطافية هو 5.0.

إذا كان المادة الطافية لا تزال أساسية جدا ، اغسل الخرزات مرة أخرى بالماء المقطر المزدوج. وفي الوقت نفسه ، أضف مزيج PCR الجولة الأولى إلى أنبوب PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. حرك السرعة الزراعية الصلبة على حافة أنبوب einor.

ثم انقل السرعة الزراعية بعناية إلى حرارة أنبوب PCR إلى 70 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة واخلطها ثم يقترح تضخيمها في البروتوكول المكتوب. بعد تضخيم الجولة الأولى ، قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للجولة الثانية باستخدام خمسة ميكرولترات من منتج الجولة الأولى كقالب. تأكد من وضع بيبا أسفل طبقة الزيت المعدني.

تابع إجراء الجولة الثانية من التضخيم وفقا لتوجيهات النص كاختبار تشخيصي. يمكن قطع عينات الجولة الثانية باستخدام إنزيم تقييد وهو مثيلة أو إجهاد كهربائي محدد لمنتجات الهضم على هلام أكريلاميد 8٪. تمثل أي نطاقات غير متجانسة تنتج أكثر من تسلسل واحد لاستنساخ منتج الجولة الثانية في المتجه وإجراء استنساخ TA كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة لهذا الفيديو بعد لوحة استنساخ TA ، كل مزيج التفاعل على لوحة أجار و LB ، مكملة بالأمبيسلين ، ex gal و IPTG واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

ثم أضف المزيج الرئيسي لمستعمرة PCR إلى أنبوب PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. اختر مستعمرة بكتيرية بيضاء من اللوحة بطرف ماصة وقم بتدويرها في 35 ميكرولترا من مزيج PCR الرئيسي في أنبوب PCR. تابع تضخيم التعليق كما هو موضح في النص بعد الرحلان الكهربائي لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل أربعة ميكرولترات من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام 1.5٪ AGROS.

أخيرا ، أرسل ما يقرب من 30 ميكرولترا من منتج PCR لتسلسل خمس مستعمرات PCRs لكل خلية. بمجرد الحصول على نتائج التسلسل ، يمكن قراءة أنماط المثيلة أي جوانين السيتوزين الأصلي الذي بقي على هذا النحو تم ميثيليته. على العكس من ذلك ، فإن أي جوانين السيتوزين الأصلي الذي أصبح الآن ثيامين جوانين غير ميثيل بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل باستخدام بادئات محولة من كبريتات ثنائية.

من الممكن تأكيد التحويل الناجح من خلال تصور حجم الجزء الصحيح على الطور الفردي لهلام aros. تمثل بويضة أليلا أبويا واحدا ومن الناحية النظرية لهما نمط مثيلة مطبوع واحد على هذا النحو. يمكن اختبار منتجات PCR في الجولة الثانية بحثا عن التلوث غير المقصود.

يمكن استخدام إنزيم تقييد حساس لمثيلة الحمض النووي لهضم منتج PCR الجولة الثانية لتقييم ما إذا كان يحتوي على أليل ميثيل أو غير ميثيل. هنا ، يتم شق السيتوزين الميثيلي داخل تسلسل التعرف على الإنزيم. في حين أن السيتوزين غير الميثيل الذي يتم تحويله إلى ثايمين لم يعد يتعرف عليه الإنزيم ويتم تقطيعه ، يجب التخلص من أي عينة من البويضة الطورية التي تحتوي على كل من الأليلات الميثيلية وغير الميثيلة لأنها تدل على تلوث الخلايا الركامية أو إدراج الجسم القطبي بعد الربط والتحول.

يمكن تصور تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الناجح للمستعمرة على هلام AROS لضمان إرسال عينات بحجم المنتج الصحيح للتسلسل. على سبيل المثال ، حجم الأمبليكون المتوقع بعد الربط هو مائة 56 زوجا أساسيا. هنا ، يحتوي الاستنساخ الخمسة على حجم amplicon غير صحيح ولا ينبغي إرساله للتسلسل.

يجب أن ينتج تسلسل خمسة نسخ فردية من بويضة الطور الطور خمسة أنماط مثيلة متطابقة ومعدلات تحويل متطابقة غير CPG. يجب التخلص من أي عينات تحتوي على أكثر من نمط واحد. نظرا لأن الطور الإباوي لهما نسختان من الكروموسوم أو جسم قطبي متصل ، فهناك إمكانية للحصول على نمطين متشابهين للتسلسل

يجب التخلص من البيانات من أي خلايا لها أنماط مثيلة مختلفة للغاية. نظرا لأنه لا يمكن استبعاد تلوث الخلايا الركامية عند محاولة هذا الإجراء ، فمن المهم أن تتذكر أولا غسل البويضات عدة مرات في وسط جديد ، بعد علاج HI IDE لإزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا الركامية. ثانيا ، سوف تتصلب درجة الانصهار المنخفضة عند درجات حرارة أقل من 65 درجة مئوية ، لذا اعمل بعناية ولكن بسرعة.

وأخيرا ، كبريتات مكرر الصوديوم والهيدروكينون حساسان للضوء ، لذلك يجب لف أنابيب ومحاليل التفاعل بورق الألمنيوم.