تركيبات لتجميد التجفيف من البكتيريا وتأثيرها على بقاء الخلية

يهدف التجربة التالية إلى ملاحظة تأثير أنواع مختلفة من تركيبات التجفيف بالتجميد على بقاء الخلايا. في البداية، يتم تحضير تركيبات مختلفة لتجفيف المزارع الخلوية بالتجميد. بعد ذلك، يتم خلط كل تركيبة مع المزرعة الخلوية، ثم تُجفف بالتجميد، ثم تُعاد ترطيبها لاحقاً لقياس معدلات البقاء.

تظهر النتائج اختلافات في معدلات البقاء على قيد الحياة يمكن ربطها بالخصائص المحددة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعدك في فهم الخصائص الفيزيائية والهيكلية للصيغة التي تعد مهمة لبقاء الخلايا أثناء التجفيف. لتحضير مزرعة بادئة من Pseudomonas putter، ابدأ بتلقيح 100 milliliters من مرق تريبتيك صويا، أو TSB، بمستعمرة من الخلايا التي تم استزراعها على آجار مدعم بمرق تريبتيك صويا أو TSB، ثم قم بحضن المزرعة عند 30 °C، مع الرج بسرعة 130 RPM لمدة سبع ساعات.

انقل جزءاً من المزرعة إلى وسط TSB جديد واتركها تنمو لمدة 16 ساعة. يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1, 500 ×g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل كتلة الخلايا المترسبة بواسطة Resus، مع تعليقها في 150 millimolar من كلوريد الصوديوم.

قم بترسيب الخلايا وإعادة تعليقها. علّق الخلايا في وسط الصياغة. لتحضير محاليل الصياغة الخاصة بالتجفيد للخلايا.

قم بوزن مكونات المصفوفة المعنية وإذابتها في الماء لتحقيق ظروف متساوية التوتر. اضبط المحلول باستخدام المادة المضافة، أو كلوريد الصوديوم، أو أي مذابات أخرى متوافقة مع الخلايا. لإعادة تعليق الخلايا بشكل متجانس في محلول منخفض اللزوجة، قم بمعالجة المحاليل عالية اللزوجة باستخدام جهاز الرج (vortex).

أضف قضيب تحريك ورُج الخليط. بعد ذلك، قسّم التركيبات على قوارير تجفيف بالتجميد موزونة مسبقاً ثم زن القوارير. اسحب 100 µL من كل عينة وأجرِ تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف، ثم ازرع التخفيفات المطلوبة واحضنها في درجة حرارة الغرفة؛ وفي حال سيتم إغلاق القوارير داخل المجفف بالتجميد، ضع سدادة مطاطية على كل قارورة من الخلايا التي تم زرعها.

قم بتعداد الخلايا في كل تركيبة. وباستخدام طريقة dune، قم بقياس التوتر السطحي للمزيج البكتيري المجفف. قم بتنظيف الحلقة البلاتينية بوضعها في لهب عديم اللون حتى يتغير لونها إلى الأحمر.

باستخدام الأسيتون ومنديل خالٍ من الوبر، اشطف وامسح وعاء القياس ثم استخدم لهباً لحرق الجزء الداخلي. املأ الوعاء بالمحلول واترك السطح يستقر قبل القياس بالنسبة للمحاليل التي تستغرق وقتاً للوصول إلى حالة التوازن. سيوفر الإعداد المستخدم هنا بيانات نوعية للتركيبات ذات اللزوجة العالية.

استخدم محلولاً بتركيز أقل لقياس التوتر السطحي واستقراء مدى ضرورة ضبط ظروف التجفيف بالتجميد وفقاً للخصائص الفيزيائية للتركيبة. ويُعد المعلمة الأكثر أهمية هي درجة حرارة الانتقال الزجاجي أو TG للتركيبة، والتي يُرمز لها بـ TG prime للعينة المركزة بالتجميد، وهي تشير إلى أن الماء لا يزال موجوداً. ولتحديد سلوك التجمد الخاص بالتركيبة، ضع من 5 إلى 10 mg من العينة في وعاء ألومنيوم مخصص لقياس المسعر المسحي التفاضلي أو DSC مع الغطاء.

قم بتجهيز وعاء فارغ كمرجع. اضبط برنامج مسح درجة حرارة DSC لمحاكاة خطوة التجميد في برنامج التجفيف بالتجميد. يتم ذلك لأن حركية التبريد يمكن أن تؤثر على TG prime للتركيبات غير المجففة قبل بدء مسح التسخين.

قم بخفض درجة الحرارة إلى مستوى أقل بكثير من درجة الانتقال الزجاجي (tg) المتوقعة. اختر معدل تسخين مناسب بناءً على التركيبات التي يتم استقصاؤها. يتم التعبير عن إشارة تدفق الحرارة المسجلة بالوات، وستتأثر بمعدل التسخين.

سيعطي معدل التسخين الأعلى إشارة أكبر لـ TG Prime؛ لذا اضبط نطاق درجة الحرارة بحيث يغطي كلًا من TG prime وانصهار التركيبة. بمجرد تحديد سلوك التجمد، قم بتعديل معايير عملية التجفيف بالتجميد بحيث تظل درجة حرارة العينة دائمًا أقل من TG الخاص بالعينة، وبحيث يسمح ضغط الغرفة بالتسامي السريع للثلج والمياه المتبقية في التركيبة. وذلك لحماية المنتجات الجافة بعد عملية التجفيف بالتجميد.

يتم التحكم في الغلاف الجوي للعينات عن طريق إغلاق العينات في المجفف بالتجميد قبل تحرير الفراغ في نهاية دورة التجفيف بالتجميد. وبدلاً من ذلك، يمكن ملء القوارير بغلاف جوي مفضل. ومن المهم تجنب تعريض العينات للظروف المحيطة، حيث إن أي رطوبة أو أكسجين يتواجد في الغلاف الجوي للتخزين سيؤثر على بقاء الخلايا.

أخيراً، قم بوزن القوارير لتحليل العينات باستخدام الأشعة السينية. ضع كمية صغيرة من المصفوفة البكتيرية على حامل العينة، ثم قم بتركيب حامل العينة في مقياس انكسار الأشعة السينية. استخدم البرنامج المتوافق مع جهاز الأشعة السينية لتحليل أي طور بلوري موجود في العينة.

لتحليل المصفوفة البكتيرية باستخدام المجهر الإلكتروني، قم بتثبيت كمية صغيرة على شريط كربوني مثبت على قاعدة مجهر إلكتروني ماسح. ضع حامل الـ SEM في جهاز الطلاء (spotter coater)، وقم بطلاء العينة بالذهب والبالاديوم أو البلاتين لتصوير العينة. ضع حامل الـ SEM في الغرفة واختر معاملات التصوير المناسبة.

على سبيل المثال، نستخدم في هذا الجهاز جهد تسريع مقداره 5 kilovolt، وحجم بقعة يبلغ 3، ومسافة عمل قدرها 5 mm، وكاشف الإلكترونات الثانوية. يسرد هذا الجدول بيانات لتركيبات مختلفة، بما في ذلك الأحداث الحرارية التي سجلها DSC أثناء تسخين التركيبات المجمدة، وبنية العينات الجافة، والتوتر السطحي لمحاليل التركيبات. وتبلغ قيمة TG prime للسكروز -40 °C، وقد يكون من الصعب اكتشاف تركيزات السكروز التي تقل عن 20% w/w.

من المرجح أن الحدث الحراري عند -35 °C مرتبط ببداية ذوبان الجليد الموضح هنا. بيانات البقاء على قيد الحياة لبكتيريا P putter سالبة الجرام وبكتيريا a CHLOROPHYL cus موجبة الجرام المصاغة في تركيبات مختلفة قائمة على السكريات. لاحظ أن الاتجاه في مدى دعم التركيبة لبقاء الخلايا متشابه لكلا النوعين من البكتيريا.

يوضح هذا المخطط العلاقة بين معدل البقاء على قيد الحياة بعد التجفيف بالتجميد والتوتر السطحي للتركيبات، مما يشير إلى أن التوترات السطحية الأعلى تؤدي إلى معدلات بقاء أكبر. تمثل صور SEM المعروضة هنا تركيبات جافة لأربعة بوليمرات مختلفة، حيث تبدو مصفوفاتها مثل الورق الهش أو صفائح ملساء مترابطة ذات أنماط متجعدة من البكتيريا المدمجة في fi وccal والسكروز. يبلغ سمك الصفائح حوالي ميكرون واحد وعرضها من 10 إلى 20 ميكرون، بينما يتميز ccal بسطح أكثر نعومة، أما HPMC وHEC فيظهران صفائح أرق بكثير.

وتكون البكتيريا أكثر وضوحاً، وربما يرجع ذلك إلى أن نسبة البوليمر إلى البكتيريا أقل في هذه التركيبات القائمة على السليلوز. علاوة على ذلك، لوحظت بلورات ملحية في HEC وHPMC، حيث أظهرت الأخيرة كمية أكبر من الرواسب على سطح رقائق البوليمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية اعتماد بقاء الخلايا على خصائص التركيبة باستخدام التقنيات الموضحة هنا.