تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

الهدف العام من التجربة التالية هو تحويل اختبار Eliza المحسن مسبقا ل TNF Alpha cytokine إلى منصة Xap أثناء تقييم أزواج الأجسام المضادة البديلة. يتم تحقيق ذلك عن طريق اقتران الجسم المضاد الملتقط من مجموعة ELIZA ، جنبا إلى جنب مع ثلاثة أجسام مضادة أخرى مرشحة لالتقاط أربع مجموعات مختلفة من الكرة المجهرية أو الخرز عند مزجها معا. تسمح هذه المجموعات الأربع بالاختبار المتزامن لجميع المرشحين الأربعة مع أربعة أجسام مضادة منفصلة لتحديد أفضل زوج من الأجسام المضادة.

يتم إنشاء فحصين تاليين من Xap باستخدام زوجين من الأجسام المضادة المثلى. ثم تتم مقارنة أداء المقايسات بأداء مقايسة EISA الأصلية فيما يتعلق بقوة الإشارة والمدى الديناميكي والحساسية. تظهر النتائج أن الأجسام المضادة المتشابهة يمكن أن تعمل بشكل مختلف تماما في ظل نفس الظروف وأنه يمكن فحص العديد من الأجسام المضادة في وقت واحد باستخدام مقايسة Luminex Xap ، مما يكشف أن الاختبار قد زاد من الحساسية والنطاق الديناميكي عند مقارنته ب EISA.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل EIS A هي أن المقايسات المناعية القائمة على xap تسمح للباحث باختبار أهداف متعددة ، أو كما في هذه الحالة ، اختبار أجسام مضادة متعددة في وقت واحد. لتحديد أفضل الأجسام المضادة التي تم إثباتها. سيكون الإجراء هو إيريكا لوبيز ، عالمة مشاركة في شركة Luminex Corporation.

ابدأ هذا البروتوكول باختيار وإعداد أربعة أجسام مضادة للالتقاط وأربعة أجسام مضادة للكشف خاصة بعامل نخر الورم البشري ألفا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. أيضا ، قم بإعداد جسم مضاد تأكيد واحد خاص بالأنواع المضيفة للأجسام المضادة الملتقطة. أحضر الكواشف الموجودة في مجموعة اقتران الأجسام المضادة إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بتسمية أربعة أنابيب تفاعل بأرقام منطقة الخرزة المحددة لتفاعل الاقتران. انقل محتويات القوارير الأربعة من الكريات المجهرية mag plex إلى أنابيب التفاعل الأربعة المسماة. اغسل كل مجموعة من مجموعات الخرزة مرتين في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط وقم بتنشيط كل مجموعة حبة باستخدام محاليل ONHS و EDC كما هو موضح في مجموعة اقتران الأجسام المضادة.

دليل المستخدم بعد حضانة لمدة 20 دقيقة على الدوار ، كرر خطوة الغسيل السابقة مع الخرز الذي تم تنشيطه الآن ما مجموعه ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط. لكل غسلة ، قم بإعداد أربعة حلول منفصلة سعة 500 ميكرولتر. يحتوي كل منها على 7.5 ميكروغرام من المخزن المؤقت لتعطيل الأجسام المضادة الملتقطة.

أضف محاليل الأجسام المضادة الأربعة هذه إلى أنابيب التفاعل الخاصة بها. دوامة كل أنبوب على الفور واحتضان لمدة ساعتين على المدور. كرر خطوة الغسيل مع الخرزات الزوجية الآن ما مجموعه ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المرفق مع مجموعة اقتران الأجسام المضادة.

بعد خطوة الغسيل النهائية ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل أنبوب تفاعل لتوفير تركيز مخزون نهائي يبلغ 5 ملايين حبة مقترنة بالأجسام المضادة لكل دوامة مليلتر ، ثم صوتنة أنابيب التفاعل لتفريق الخرز. احسب عدد الخرزات التي تم استردادها بعد تفاعل الاقتران باستخدام عداد الخلية أو مقياس الخلوي الدموي. عادة ما يكون التعافي من تفاعل الاقتران أكثر من 90٪ تأكد من نجاح تفاعل الاقتران من خلال إعداد محاليل اختبار مخزون الخرز المقترن لكل مجموعة بتركيز نهائي يبلغ 100 حبة لكل ميكرولتر في المخزن المؤقت للفحص ، وإعداد تخفيف من الأنواع المضادة للأنواع المضادة.

الجسم المضاد للتأكيد IgG بمقدار أربعة ميكروغرام لكل مليلتر في مخزن مؤقت للفحص 50 ميكرولترا من كل محلول اختبار في أربعة آبار من صفيحة بئر 96 قاعية مستديرة ليصبح المجموع 16 بئرا. ثم أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص في ثمانية من الآبار لقياس الخلفية و 50 ميكرولترا من الجسم المضاد المؤكد المخفف في الآبار الثمانية المتبقية. امزج التفاعلات برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات.

غطي الطبق واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر الطبق. ضع اللوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة دقيقة إلى دقيقتين لسحب الخرزات من المحلول. ثم قم بإزالة السائل عن طريق قلب اللوحة بقوة أثناء وضعها على الفاصل فوق وعاء النفايات.

اغسل كل بئر مرتين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت وإزالة SANE من اللوحة بطريقة مماثلة. باستخدام فاصل اللوحة المغناطيسية ، قم بإعادة تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل خمس مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات. التحليل على أداة luminex xap مثل أداة magix.

تتناسب شدة إشارة الفلورسنت لهذا التفاعل طرديا مع كمية البروتين على سطح الخرزات ، مما يوفر تقييما سريعا للكمية النسبية للبروتين المقترن بالخرز. لتحديد زوج الأجسام المضادة الأكثر فعالية في مقايسة xap ، قم بإعداد خليط أولي من جميع مجموعات الخرز الأربعة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كل منها إلى 0.96 مل من المخزن المؤقت للمقايسة. قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة للكشف عن طريق تخفيف كل جسم مضاد إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في مخزن الفحص.

أيضا مخزن مؤقت للفحص. قم بإعداد أنظمة r و d معيار بروتين TNF alpha عند 2000 بيكوغرام لكل مليلتر وقم بتخفيف Streptavidin R FICO eryn إلى ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر. أضف 50 ميكرولترا من خليط الخرز المقترن بالأجسام المضادة إلى كل من 16 بئرا من لوحة بئر 96 القاع المستديرة من CoStar لفحص الفحص.

ثم أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص إلى ثمانية من 16 بئرا لقياس الخلفية. بعد ذلك ، قم بعمل 50 ميكرولترا من معيار TNF alpha إلى الآبار الثمانية الأخرى لقياس الاستجابة. احتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء أثناء الرج على شاكر لوحة الفحص.

ثم أضف 50 ميكرولترا من كل من الأجسام المضادة الأربعة للكشف إلى أربعة آبار ، اثنان منها آبار خلفية ، واثنان منها آبار استجابة. احتضن لمدة 30 دقيقة في نفس الظروف بعد إضافة 50 ميكرولترا من كاشف SAPE إلى جميع الآبار. احتضن مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في نفس الظروف.

ضع اللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإزالة السائل عن طريق قلب اللوحة بقوة أثناء وضعها على الفاصل فوق وعاء النفايات. ماصة 100 ميكرولتر من مخزن الفحص لكل بئر من الآبار ال 16.

ثم قم بإزالة السائل من الخرز باستخدام الفصل المغناطيسي. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت لكل بئر من البئر ال 16. اقرأ اللوحة باستخدام أداة Luminex mag Picks التي تشير إلى دليل المستخدم للتشغيل السليم.

حدد زوجا من الأجسام المضادة يلبي قوة الإشارة المطلوبة. بعد اختيار الأفضل لالتقاط الجسم المضاد ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من هذا الجسم المضاد المقترن بمخزون الضرب إلى 10 ملليلتر باستخدام مخزن مؤقت للفحص. أضف 50 ميكرولترا من الخرزات المخففة إلى 78 بئرا من لوحين مستديرين من 96 لوح بئر من CoStar.

سيتم استخدام كل لوحة لتقييم أداء جسم مضاد مختلف للكشف. بعد ذلك ، قم بإعداد منحنى قياسي مكون من 12 نقطة يبدأ من 8 ، 000 بيكوجرام لكل مليلتر وينتهي بأربعة بيكوغرام لكل مليلتر. مع أنظمة البحث والتطوير.

يضيف معيار TNF Alpha ستة مكررات سعة 50 ميكرولتر من كل تخفيف لكل لوحة ، بالإضافة إلى ستة آبار بها 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص كخلفية ليصبح المجموع 78 بئرا لكل لوحة. احتضان الألواح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء أثناء الاهتزاز على شاكر لوحة الفحص. ثم أضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأول للكشف إلى جميع الآبار ال 78 في اللوحة الأولى.

كرر ذلك للجسم المضاد للكشف الثاني على اللوحة الثانية. احتضن الأطباق لمدة 30 دقيقة في نفس الظروف. ثم أضف 50 ميكرولترا من كاشف SAPE إلى جميع آبار كل لوحة.

بعد هز اللوحين لمدة 15 دقيقة محميين من الضوء ، ضع الألواح على فواصل الألواح المغناطيسية لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة السائل عن طريق قلب اللوحة بقوة أثناء وضعها على الفاصل فوق وعاء النفايات. بعد ذلك ، قم بعمل ماصة 100 ميكرولتر من عازلة الفحص لكل بئر من البئر ال 78 الموجودة على الألواح قبل إزالة السائل من الخرز المغناطيسي.

بعد إضافة مائة ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى الخرز في كل من الآبار ال 78 الموجودة على الألواح ، قم بتحليل الألواح الموجودة على أداة اختيار ماج بالإشارة إلى دليل المستخدم للتشغيل السليم. باتباع التعليمات المضمنة في أنظمة r و d ، فإن مجموعة TNF Alpha T NF SF البشرية مجموعة ELI A. قم بقياس الاستجابة الناتجة عن المعيار المقدم مع مجموعة r و d.

كرر اختبار ELI ثلاث مرات أخرى لاستبدال الأجسام المضادة لنظامي r و d والكشف عنهما بالأجسام المضادة للبائعين الآخرين. من أجل البساطة ، قم بإقران الأجسام المضادة حسب البائع ، وقم بتقييم كل زوج بشكل مستقل كما هو مطلوب في تنسيق EISA مع كل من معايير بروتين TNF Alpha الثلاثة. تم إجراء فحوصات Luminex Xap كمضاعف لتقييم جميع الأجسام المضادة الأربعة الملتقطة كخليط من خلال الجمع بين أربع مجموعات من الأجسام المضادة لعامل نخر الورم ألفا مقترنة بالكريات المجهرية Mag PLX ، وتم تقييم الأجسام المضادة الملتقطة مع كل من الأجسام المضادة الأربعة للكشف عن البيوتينيل بشكل فردي ، بحيث يمكن تحديد تفاعل جسم مضاد واحد للكشف مع كل من الأجسام المضادة الأربعة الملتقطة في وقت واحد.

أشارت النتائج إلى أن زوج الأجسام المضادة من مجموعة DUO لنظامي r و d كان أفضل أداء مع استجابة ناتجة عند 6 ، 183 متوسطة شدة مضان أو وحدات MFI. لوحظ أيضا أن الأجسام المضادة للكشف من Millipore و ABAM قدمت استجابة معقولة في اختبار XAP عند دمجها مع الأجسام المضادة لالتقاط أنظمة RD ، أنتجت الأجسام المضادة الملتقطة من Millipore و ACAM و Novus استجابة أقل استصواب في اختبار XAP. تم استخدام بروتوكول مجموعة DUO لنظامي r و d لمقارنة أزواج الأجسام المضادة الأربعة بتنسيق EISA.

تم استخدام بروتوكول أنظمة r و d مع جميع أزواج الأجسام المضادة لأنه يعكس بروتوكولات تقييم الأثر البيئي النموذجية المستخدمة على نطاق واسع اليوم ، وهو مشابه للبروتوكولات المستخدمة مع تقنية xap. أظهرت اختبارات EISA أن زوج الأجسام المضادة من أنظمة r و d أعطى أفضل النتائج مرة أخرى. لم ينتج زوج الأجسام المضادة من Acam أي استجابة ، وأنتجت أزواج الأجسام المضادة من Millipore و Novas استجابات متواضعة من أجل تقييم أي اختلاف في تفاعل الأجسام المضادة.

مع المعيار ، تم اختبار جميع أزواج الأجسام المضادة الأربعة بثلاثة معايير مختلفة لبروتين ألفا المؤتلف من ثلاثة بائعين مختلفين. تظهر البيانات أن معايير بروتين ألفا المؤتلف من TNF من البائعين الثلاثة أعطت نتائج مكافئة. تم استخدام بروتين نخر الورم ألفا من أنظمة r و d لتوليد منحنيات قياسية باستخدام فحوصات ELSA و XAP.

بينما تم إجراء اختبار ELI A باستخدام زوج الأجسام المضادة لنظام r و d ، استخدمت فحوصات xap الجسم المضاد لالتقاط نظام r و d وإما الجسم المضاد للكشف من أنظمة r و d أو Millipore. تم تخفيف بروتين ألفا TNF من أنظمة r و d لإنتاج مجموعة من التركيزات من 8،000 إلى أربعة بيكوغرام لكل مليلتر فقط. أنتج زوج الأجسام المضادة من أنظمة r و d النتيجة المتوقعة في اختبار Xap مع استجابة أكبر من 20,000 MFI كما هو موضح.

عندما تم استخدام الجسم المضاد للكشف من Millipore مع اختبار Xap بدلا من الجسم المضاد للكشف عن أنظمة r و d ، كانت الاستجابة حوالي 30٪ من الاستجابة التي تم الحصول عليها مع الجسم المضاد للكشف من أنظمة RD. يمثل الخط الأخضر على هذا الرسم البياني المنحنى القياسي ل ELA ، والذي كان لديه نطاق TNF alpha الموصى به من قبل الشركة المصنعة من 16 إلى 1000 بيكوغرام لكل مليلتر. نظرا لحد مقياس الطيف الضوئي ، لم يكن من الممكن زيادة نطاق اختبار إليزا.

علاوة على ذلك ، يتم توضيح المدى الدينامي وحساسية كلتا الطريقتين بشكل أفضل عند رسمهما في مقياس لوغاريتمي. يمكن رؤية تمييز واضح بين ميل استجابة EISA والاستجابات من فحوصات xap ويشير أيضا إلى قدرة أكثر تقييدا للكشف عن عامل نخر الورم ألفا باستخدام EL iza بتركيزات أعلى وأقل. تم تقريب حدود الكشف أو LOD لمقايسات TNF alpha xap الوظيفية من خلال تحديد أدنى تركيز ألفا لعامل نخر الورم بمستوى استجابة ملحوظ أكبر من الخلفية ، بالإضافة إلى ثلاثة أضعاف انحرافه المعياري أو SD من ستة مكررات.

هنا يمكن ملاحظة أنه عند استخدام زوج نظامي r و d ، أنتج أدنى تركيز ألفا لعامل نخر الورم عند 3.91 بيكوغرام لكل مليلتر استجابة قدرها 66 MFI ، وهي أكبر من الاستجابة للخلفية بالإضافة إلى ثلاثة اجتماعات SD. هذه المعايير. عندما تم استخدام الجسم المضاد للكشف عن المليبور مع الجسمان المضادين لنظامي r و d ، كان حد الكشف أقل من 7.81 بيكوغرام لكل ملليلتر.

في هذه الحالة ، تم إنتاج ثاني أدنى تركيز ألفا لعامل نخر الورم في استجابة مقبولة تبلغ 17 MFI أكبر من استجابة أدنى تركيز ألفا لعامل نخر الورم بالإضافة إلى ثلاثة أضعاف انحرافه المعياري. وبالمثل ، قدر حد الكشف عن مجموعة الثنائي لأنظمة البحث والتطوير إليزا بين 63 و 31 بيكوغراما لكل مليلتر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ خطوات أخرى مثل الاختبار أو مصفوفات العينات المختلفة أو تركيزات الأجسام المضادة في المراسل من أجل تحسين مقايسة xap بشكل أكبر.