عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

هذا مغناطيس Max MIDI. مكتوب عليه: تحذير، مجالات مغناطيسية قوية للغاية. مرحباً، أنا ميلاني ماثيو من مختبر مايك كولينز في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا، إيرفاين.

سنقوم اليوم بعرض طريقة تحضير خلايا T الموجبة لـ CD4 باستخدام تقنية الاختيار السلبي عبر أطقم Milton biotechnology. لدينا هنا جهازي minimax وminimax magnets، حيث يُستخدم minimax لعمليات الفصل الأكبر حجماً، إذ يمكن تمرير ما يصل إلى 10⁹ خلية عبر عمود يتناسب مع جهاز minimax، بينما يُستخدم minimax magnets لأحجام أصغر بكثير من الخلايا.

لذلك، وبناءً على ما إذا كنت تقوم بعملية فصل إيجابي أو سلبي، فستقوم بتمييز خلاياك باستخدام الجسم المضاد المناسب. تحتوي هذه الأجسام على حبيبات مغناطيسية تلتصق بالمغناطيس. وفي حالة الاختيار السلبي، ستمر الخلايا التي تهمك عبر العمود، ويمكنك حينئذٍ جمع السائل المار، والذي سيحتوي على الخلايا المستهدفة.

يجب أن أشير إلى أن التقنيات التي أعرضها لكم الليلة ليست معقمة. لذا، إذا كنتم ترغبون في استخدام هذه الخلايا في المزارع الخلوية، فيجب تنفيذ كل الخطوات داخل غطاء زراعة الأنسجة باستخدام أدوات معقمة. وبالرغم من أنني أعرض لكم طريقة تحضير خلايا T الموجبة لـ CD4، إلا أن العديد من هذه التقنيات قابلة للتطبيق في تنقية أنواع أخرى من الخلايا باستخدام مجموعات Miltenyi Biotechnology.

حسنًا، لقد قمت باستئصال العقد اللمفاوية من الفأر، وقد أوضحت لكم كيفية القيام بذلك بالتفصيل في العدد السابع من JoVE حول تحضير العقد اللمفاوية للتصوير ثنائي الفوتون. والآن سأقوم بطحن العقد اللمفاوية لتحويلها إلى معلق خلوي أحادي داخل مصفاة خلايا بمقاس 70 micron. حسنًا، سأقوم الآن بطحن العقد اللمفاوية إلى معلق خلوي أحادي باستخدام الجزء الخلفي من محقنة سعة 6 milliliter.

توجد العقد اللمفاوية في وسط RPMI داخل مرشح، ومن المهم تحضير معلق خلايا مفردة بشكل صحيح. والسبب في استخدام المرشح هو ضمان عدم وجود أي تكتلات خلوية. لذا، عند الانتهاء من عملية السحق، سأخرج المرشح من الوسط ثم أستخدم جميع الخلايا التي مرت عبر المصفاة للحصول على معلق الخلايا المفردة.

عند القيام بعملية الطحن، يجب التأكد من تفتيت جميع الأنسجة قدر الإمكان. هذا المعلق من الخلايا المفردة هو ما سنقوم من خلاله بتنقية الخلايا التائية الموجبة لـ CD4. حسناً، لقد انتهيت الآن من طحن الأنسجة، ويمكنكم رؤية أن معظم العقد اللمفاوية قد تفتتت تماماً.

لا يزال لدينا بعض القطع الصغيرة من الدهون وما يشبه غلاف العقدة اللمفاوية هنا مع القليل من النسيج الضام، وكلها متلاصقة من العقد اللمفاوية الست جميعها. والآن أقوم بإزالة مصفاة الخلايا. ويمكنكم أن تروا هنا أن الوسط عكر للغاية.

إنها ممتلئة بالخلايا من معلق الخلايا المفردة لضمان الحصول على أقصى عدد من الخلايا من المرشح، حيث سيلتصق بعضها به. أغسله ببضع مللي لترات من الوسط الغذائي، ثم أنقل كل الوسط الغذائي باستخدام الماصة إلى أنبوب Falcon سعة 15 مل، وأقوم بطرد مركزي لترسيب الخلايا من أجل التنقية اللاحقة. إليكم الآن معلق الخلايا المفردة الخاص بي، بعد طرده مركزياً وترسيبه عند 300 G لمدة 10 دقائق.

إذا كنت تعتقد أن لديك تعداداً مرتفعاً من الخلايا الميتة في معلق الخلايا المفردة، فمن الجيد استخدام طقم إزالة الخلايا الميتة من شركة Miltenyi. والآن وبعد أن حصلت على هذه الرواسب، سأقوم بسكب الوسط الغذائي وإجراء تحلل لكريات الدم الحمراء، ثم سأقوم بعدها بتعداد الخلايا، ومن ثم استخدام طقم اختيار سلبي لخلايا T السالبة والـ CD4 الموجبة على هذه الخلايا تحديداً. حسناً، سأقوم الآن بإجراء تحلل لكريات الدم الحمراء (RBC lysis).

سنقوم بتحليل خلايا الدم الحمراء التي قمنا بترسيبها مع الخلايا اللمفاوية عن طريق خفض اسموزية المحلول، وذلك بإضافة الماء أولاً، ثم إعادة المحلول إلى تركيز 1x بإضافة 10X-D-B-P-S. إن الخلايا اللمفاوية لدينا أكثر مقاومة للتغير في الاسموزية مقارنة بخلايا الدم الحمراء، ولكن لا يزال يتعين علينا العمل بسرعة وإلا سنقوم بتحليل الخلايا اللمفاوية، وهو أمر لا نريده. ومن ضمن خطوات العمل بسرعة أن أقوم بتجهيز الأحجام التي سأحتاجها لعملية التحليل قبل البدء فعلياً في إضافة الماء إلى النظام.

لذا، أرغب في إضافة 10 X-D-B-P-S بعد بضع ثوانٍ من إضافة الماء للتأكد من عدم تحلل الخلايا اللمفاوية مع ضمان تحلل خلايا الدم الحمراء. لذا، آخذ 900 µL من الماء، وهو ما يقارب 1 mL، و 100 µL من 10 X-D-B-P-S.

لقد جهزت كلا الأنبوبين. في مرحلة التحلل، أضيف الماء، وأنتظر لبضع ثوانٍ، وربما هز الأنبوب قليلاً، ثم أضيف 10 X-D-B-P-S، وأهز الأنبوب أكثر قليلاً. وإذا كنت تقوم بتحليل عدد كبير من خلايا الدم الحمراء، فستلاحظ تكون كتلة كبيرة غير متبلورة من جميع أغشية الخلايا المتحللة.

لدينا كمية قليلة منها هنا، ويمكنكم رؤية أنها عبارة عن بعض أغشية الخلايا الممزقة. لذا، بعد إتمام عملية التحلل، وتحسباً لوقوع أي خطأ في عملية النقل بالماصة، أفضل إضافة بضعة ملليلترات من الوسط الغذائي إلى الخلايا للتأكد من أن الأسمولية صحيحة ولضمان عدم استمرار عملية التحلل بشكل أكبر. حسناً، لدي الآن الخلايا الليمفاوية في معلق خلوي أحادي.

مرة أخرى، لقد أجريت عملية تحلل كريات الدم الحمراء، وسأقوم الآن بطردها مركزياً لترسيبها. وقبل القيام بذلك، سأقوم بعدّها باستخدام مقياس خلايا الدم (hemo cytometer) لتحديد كمية الأجسام المضادة التي نحتاج إلى إضافتها لمجموعة اختيار سلبي الخلايا التائية الموجبة لـ CD4. حسناً، أقوم الآن بطرد الخلايا مركزياً في محلول max buffer، ويمكنكم ملاحظة أن الراسب أصبح أكثر بياضاً بعد إجراء عملية تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis).

سأقوم بإجراء عملية اختيار سلبي للخلايا التائية الموجبة لـ CD4. لذا، سأقوم بسكب جميع الأوساط، وجميع محلول max buffer الذي استخدمته لترسيب الخلايا. ومن ثم سأقوم بالوسم باستخدام كوكتيل أجسام مضادة مرتبطة بالبيوتين، وهي الخطوة الأولى في عملية الاختيار السلبي للخلايا التائية الموجبة لـ CD4.

بعد ذلك، أقوم بالتحضين في الثلاجة لمدة 10 دقائق. حسناً، لقد انتهت الخلايا من عملية التحضين الأولية. سأقوم الآن بإضافة المضاد الحيوي إلى الخرزات الدقيقة (microbeads) وإعادتها إلى الثلاجة لمدة 15 دقيقة.

لإجراء عملية فصل الخلايا هذه تحديداً، نستخدم عمود LS من شركة Miltenyi Biotec، وسنقوم بوضعه على الحامل المغناطيسي وتجهيز العمود بتمرير 3 mL من محلول max buffer من خلاله؛ حيث سنفتح العمود ونضعه بحيث تكون الأسنان متجهة للداخل نحو المغناطيس. والآن سأضيف محلول max buffer إلى العمود، وستلاحظون تدفقه عبر عمود LS وبدء تقاطره من الأسفل. لا داعي للقلق من جفاف العمود.

سيمنع التوتر السطحي للسائل جفافه حتى تقوم بإضافة خلاياك. ومن المهم، قبل إضافة الخلايا، ترك منظم max buffer يتخلل العمود تماماً. حسناً، بعد فترة تحضين لمدة 15 دقيقة مع خرزات البيوتين المغناطيسية المعلقة في الخلايا ومنظم max buffer، سأقوم بسكب المنظم، ثم إعادة تعليق الخلايا في كمية من المنظم تكون مناسبة لعدد الخلايا لدينا.

لذا، سيتعين عليك مراجعة بروتوكول mini tiny الخاص بك بخصوص ذلك. ومن ثم، سأقوم بتطبيقها على العمود الذي شطفناه للتو باستخدام max buffer. والآن سنضيف معلق الخلايا إلى العمود.

وبما أن هذا العمود مخصص للاختيار السلبي، فسنقوم بجمع الخلايا التي تدفقت من خلاله، والتي يجب أن تكون جميعها خلايا T موجبة لـ CD4 في هذه الحالة. والآن سأقوم بغسل العمود بـ 12 mls من max buffer، ومرة أخرى، سنجمع السائل المنساب والذي يجب أن يحتوي فقط على خلايا T موجبة لـ CD4. سأقوم الآن بعملية الطرد المركزي للخلايا T موجبة لـ CD4 لترسيبها، ثم إعادة تعليقها، وبعد ذلك وسمها بالصبغة المناسبة التي سأستخدمها لتصوير tau.

سأقوم أيضاً بأخذ عينة صغيرة من الخلايا التي نقيتها ووسمها بـ anti CD three و anti CD four ثم تحليلها باستخدام جهاز FACS للتأكد من الحصول على مجموعة نقية من الخلايا التائية الموجبة لـ CD four. إليكم نظرة على الخلايا التي قمنا بتدويرها مؤخراً؛ حيث يُفترض أن تكون هذه المجموعة مكونة من خلايا تائية نقية موجبة لـ CD three و CD four.

لقد عرضتُ لكم للتو عملية الاختيار السلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة. وباستخدام مجموعة أدوات Miltenyi Biotec، سنقوم بنقل هذه الخلايا تكييفياً إلى فأر واستخدامه في إحدى تجاربنا الخاصة بجهاز T-Photon. تمنياتي لكم بالتوفيق في تجاربكم الخاصة.