عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

هذا مغناطيس Max MIDI. ومكتوب عليه: تحذير، مجالات مغناطيسية قوية للغاية. مرحباً، أنا ميلاني ماثيو من مختبر مايك كولينز في جامعة كاليفورنيا إيرفاين، قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية.

سنعرض لكم اليوم طريقة تحضير خلايا T الموجبة لـ CD4 باستخدام تقنية الاختيار السلبي باستعمال أطقم Milton biotechnology. لدينا هنا جهاز minimax وأجهزة minimax magnets، حيث يُستخدم minimax لعمليات الفصل الأكبر حجماً؛ إذ يمكن تمرير ما يصل إلى 10⁹ من الخلايا عبر عمود يتناسب مع minimax، بينما تُستخدم minimax magnets لأحجام الخلايا الأصغر بكثير.

لذلك، وبناءً على ما إذا كنت تقوم بفصل إيجابي أو سلبي، ستعمل على وسم خلاياك باستخدام الجسم المضاد المناسب. تحتوي هذه الأجسام على حبيبات مغناطيسية تلتصق بالمغناطيس. وفي حالة الاختيار السلبي، ستمر الخلايا التي تهتم بها عبر العمود، ويمكنك حينها جمع السائل المار، والذي سيحتوي على الخلايا المستهدفة.

يجب أن أشير إلى أن التقنيات التي سأعرضها لكم الليلة ليست معقمة. لذا، إذا كنتم ترغبون في استخدام هذه الخلايا في المزارع الخلوية، فيتعين عليكم إجراء كافة الخطوات داخل غطاء زراعة الأنسجة وباستخدام أدوات معقمة. وعلى الرغم من أنني أعرض لكم طريقة تحضير خلايا T الموجبة لـ CD4، فإن العديد من هذه التقنيات قابلة للتطبيق في تنقية أنواع أخرى من الخلايا باستخدام مجموعات Miltenyi Biotechnology.

حسنًا، لقد قمت باستئصال العقد اللمفاوية من الفأر، وأوضح لكم كيفية القيام بذلك بالتفصيل في الإصدار السابع من JoVE بعنوان "تحضير العقد اللمفاوية للتصوير ثنائي الفوتون". والآن سأقوم بطحن العقد اللمفاوية لتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة داخل مصفاة خلايا بمسامية 70 micron. حسنًا، سأقوم الآن بطحن العقد اللمفاوية إلى معلق من الخلايا المفردة باستخدام الجزء الخلفي من حقنة سعة 6 mL.

توجد العقد اللمفاوية في وسط RPMI داخل مرشح، ومن المهم تحضير معلق خلوي أحادي الخلايا بشكل صحيح. والسبب في استخدام المرشح هو التأكد من عدم وجود أي تكتلات خلوية. لذا، عند الانتهاء من عملية الطحن، سأقوم بإخراج المرشح من الوسط ثم استخدام جميع الخلايا التي مرت عبر المصفاة للحصول على معلق خلوي أحادي الخلايا.

عند القيام بعملية السحق، يجب التأكد من تفتيت كافة الأنسجة قدر الإمكان. هذا المعلق من الخلايا المفردة هو ما سنقوم من خلاله بتنقية الخلايا التائية CD4 الموجبة. حسنًا، لقد انتهيت الآن من سحق الأنسجة، وكما تلاحظون، فإن معظم العقد الليمفاوية قد تلاشت تقريبًا.

لا يزال لدينا بعض القطع الصغيرة من الدهون وما يشبه غلاف العقدة اللمفاوية هنا مع القليل من النسيج الضام، والتي تكتلت جميعاً من العقد اللمفاوية الست. والآن أقوم بإزالة مصفاة الخلايا. ويمكنكم أن تروا هنا أن الوسط الغذائي عكر للغاية.

إنها مليئة بالخلايا من معلق الخلايا المفردة لضمان الحصول على أقصى عدد من الخلايا من المرشح، حيث سيلتصق بعضها به. أقوم بغسلها ببضعة مليلترات من الوسط، ثم أنقل جميع الوسط باستخدام الماصة إلى أنبوب فالكون سعة 15 مليلتر، وأقوم بطردها مركزياً لترسيب الخلايا من أجل التنقية اللاحقة. ها هو معلق الخلايا المفردة الخاص بي، بعد أن تم طرده مركزياً وترسيبه عند 300 G لمدة 10 دقائق.

إذا كنت تعتقد أنه سيكون لديك عدد كبير من الخلايا الميتة في معلق الخلايا المفردة، فمن الجيد استخدام طقم إزالة الخلايا الميتة من شركة Miltenyi. والآن بعد أن قمت بترسيب هذه الخلايا، سأقوم بسكب الوسط ومن ثم إجراء تحلل لكريات الدم الحمراء، وبعد ذلك سأقوم بعدّ الخلايا ثم استخدام طقم الاختيار السلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة على هذه الخلايا تحديداً. حسناً، سأقوم الآن بإجراء تحلل لكريات الدم الحمراء RBC lysis.

سنقوم بتحليل كريات الدم الحمراء التي قمنا بترسيبها مع الخلايا اللمفاوية عن طريق خفض الأسمولارية للمحلول، وذلك بإضافة الماء أولاً ثم إعادتها إلى محلول بتركيز 1x عن طريق إضافة 10X-D-B-P-S. تُعد الخلايا اللمفاوية أكثر مقاومة للتغير في الأسمولارية من كريات الدم الحمراء، ومع ذلك يجب علينا العمل بسرعة لتجنب تحليل الخلايا اللمفاوية، وهو ما لا نريده. ومن أجل العمل بسرعة، أقوم بتجهيز الأحجام التي سأحتاجها لعملية التحليل قبل البدء فعلياً بإضافة الماء إلى النظام.

لذا، أريد أن أتمكن من إضافة 10 X-D-B-P-S بعد بضع ثوانٍ من إضافة الماء، للتأكد من عدم تحلل الخلايا اللمفاوية مع ضمان تحلل خلايا الدم الحمراء. لذا، آخذ 900 µL من الماء، وهي كمية تقارب 1 mL، و100 µL من 10 X-D-B-P-S.

لقد جهزت كلا الأنبوبين. في مرحلة التحلل، أضيف الماء، وأنتظر لبضع ثوانٍ، وربما أرج الأنبوب قليلاً، ثم أضيف 10 X-D-B-P-S، وأرج الأنبوب أكثر قليلاً. وإذا كنت تقوم بتحليل عدد كبير من خلايا الدم الحمراء، فسترى تكون كتلة كبيرة غير متبلورة من جميع أغشية الخلايا المكسورة.

لدينا كمية قليلة منها هنا، ويمكنكم رؤية وجود بعض الأغشية الخلوية الممزقة. لذا، بعد إجراء عملية التحلل، وتحسباً لوقوع أي خطأ في عملية السحب بالماصة، أفضل إضافة بضع مليلترات من الوسط الغذائي إلى الخلايا للتأكد من صحة الاسموزية ومنع استمرار عملية التحلل. حسناً، لدي الآن الخلايا اللمفاوية في معلق خلوي مفرد.

لقد قمت مرة أخرى بعملية تحلل كريات الدم الحمراء، وسأقوم الآن بطردها مركزياً لترسيبها. وقبل القيام بذلك، سأقوم بعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتحديد كمية الأجسام المضادة التي نحتاج إلى إضافتها لمجموعة أدوات الاختيار السلبي للخلايا التائية الموجبة لـ CD4. حسناً، أقوم الآن بطرد الخلايا مركزياً في محلول max buffer، ويمكنكم ملاحظة أن الراسب أصبح أكثر بياضاً بعد إتمام عملية تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis).

وسأقوم بإجراء عملية اختيار سلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة. لذا، سأقوم بسكب جميع الأوساط، وجميع محلول Max buffer الذي استُخدم لترسيب الخلايا. ثم سأقوم بوضع علامة باستخدام كوكتيل الأجسام المضادة الملحقة بالبيوتين، وهي الخطوة الأولى في عملية الاختيار السلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة.

ثم أقوم بالتحضين في الثلاجة لمدة 10 دقائق. حسناً، لقد انتهت الخلايا من عملية التحضين الأولية. سأقوم الآن بإضافة المضاد الحيوي إلى الخرزات الدقيقة (microbeads) وإعادتها إلى الثلاجة لمدة 15 دقيقة.

بالنسبة لعملية فصل الخلايا هذه، نستخدم عمود LS من شركة Miltenyi Biotec، حيث سنقوم بوضعه على الحامل المغناطيسي وتجهيز العمود بتمرير 3 mL من منظم max buffer من خلاله، سنفتح العمود ونضعه بحيث تكون الأسنان مواجهة للداخل باتجاه المغناطيس. سأقوم الآن بإضافة max buffer إلى العمود، ويجب أن تلاحظه وهو ينزل عبر عمود LS ويبدأ في التنقيط من الأسفل. لا تقلق بشأن جفاف العمود.

سوف يمنع التوتر السطحي للسائل جفافه حتى تقوم بإضافة الخلايا. وقبل إضافة الخلايا، من المهم السماح لمنظم max بالتشرب تماماً عبر العمود. حسناً، بعد فترة تحضين لمدة 15 دقيقة مع حبيبات biotin المغناطيسية التي أضفتها إلى الخلايا ومنظم max، سأقوم بسكب المنظم، ثم إعادة تعليق الخلايا في كمية من المنظم تكون مناسبة لعدد الخلايا لدينا.

لذا سيتعين عليك مراجعة بروتوكول milli tiny الخاص بك لهذا الغرض. وبعد ذلك سأقوم بتطبيقها على العمود الذي قمنا بشطفه للتو باستخدام max buffer. والآن سنضيف معلق الخلايا إلى العمود.

وبما أن هذا عمود اختيار سلبي، فسنقوم بجمع الخلايا التي تدفقت عبره، والتي يجب أن تكون جميعها خلايا T موجبة لـ CD4 في هذه الحالة. لذا، سأقوم الآن بغسل العمود باستخدام 12 mils من max buffer، ومرة أخرى، سنقوم بجمع النضيح الذي يجب أن يحتوي فقط على خلايا T موجبة لـ CD4. والآن سأقوم بطرد خلايا T موجبة لـ CD4 مركزياً، ثم إعادة تعليقها، وبعد ذلك وسمها بالصبغة المناسبة التي سأستخدمها في تصوير tau.

سأقوم أيضاً بأخذ عينة صغيرة من الخلايا التي قمت بتنقيتها وتوسيمها باستخدام anti CD three و anti CD four، ثم تشغيلها على جهاز FACS للتأكد من حصولي على مجموعة نقية من الخلايا التائية الموجبة لـ CD four. إليكم الآن نظرة على الخلايا التي قمنا بتدويرها طردياً للتو؛ حيث من المفترض أن تكون هذه مجموعة نقية من الخلايا التائية الموجبة لـ CD three و CD four.

لقد عرضتُ لكم للتو عملية الاختيار السلبي لخلايا T الموجبة لـ CD4. باستخدام مجموعة أدوات Miltenyi Biotec، سنقوم بنقل هذه الخلايا تكيّفياً إلى فأر واستخدامها في إحدى تجارب T Photon and machine الخاصة بنا. حظاً موفقاً في تجاربكم الخاصة.