الآلي الكمي من الإسفار متشابك في C. ايليجانس
August 10th, 2012
وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في نقاط الاشتباك العصبي تؤثر تأثيرا قويا قوة متشابك. هذا الأسلوب الكمي المستقبلات العصبية fluorescently المسمى في ثلاثة أبعاد مع قرار واحد في المشبك C. ايليجانس، مما يسمح للمئات من نقاط الاشتباك العصبي يتميز بسرعة في عينة واحدة من دون التشوهات التي أدخلتها Z-طائرة الإسقاط.
الهدف من هذا الإجراء هو تحديد أبعاد وسطوع إشارات الفلورسنت المنقطة في gans بكفاءة. لذلك يمكن تحليل مجموعات كبيرة من الأشياء. يتم تصوير البروتينات المتشابكة إحصائيا.
في هذا العرض التوضيحي ، تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في إنشاء ثقافات متزامنة عالية الكثافة من ELEGANS ذات الأهمية. بعد ذلك ، احصل على صور متحدة البؤر للمشابك المسماة تقلل من تباين واحد إلى واحد من الصور. يتم تحديد البزل المشبكي تلقائيا وتمييزه عن مضان الخلفية.
الخطوة الأخيرة هي جدولة البيانات وتنظيمها من أجل تحليل نهائي فعال. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج بدقة كيف تؤثر الظروف التجريبية على توزيع البروتينات المشبكية أو أي بروتين آخر موضعي في ثقب عالي التباين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تحليل توقعات Zack هي أنه يتم الحفاظ على جميع البيانات ، بما في ذلك أحجام المشبك وتحديد التحديد الآلي يسمح بالجمع السريع لمئات العينات لكل حالة. اختبار.
يتطلب هذا البروتوكول ثقافات عالية الكثافة لديدان CL egan البالغة التي نمت في ألواح أجار NGM ببتيد عالية 10 سم على بكتيريا NA 22 e القولونية جاهزة للوحة واحدة بالضبط لكل بقعة مناعية مخطط لها. ابدأ بحصاد الديدان وبضعة ملليلتر من الماء. انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وكرر هذه العملية حتى يتم جمع معظم الديدان.
حبيبات الديدان وغسل الحبيبات بالماء حتى ثلاث مرات حتى تصبح سوبينات صافية. هذا يزيل البكتيريا المتبقية دائما المحاليل التي قد تحتوي أو تحتوي على ديدان أو بيض بماصات بلاستيكية لأنها يمكن أن تلتصق بالزجاج. من الأهمية بمكان الآن التحرك بسرعة من خلال الخطوات المتبقية لمنع فقدان صلاحية البويضات للبقاء.
حرر بيض الدودة عن طريق إعادة ثنيها في خمسة ملليلتر من محلول هيبوكلوريت القلوي. هز الأنابيب برفق وفحصها تحت مجهر تشريح مرة واحدة في الدقيقة. بعد خمس دقائق ، أو بمجرد أن يظهر حوالي نصف الديدان في الأنبوب منحنية ومفتوحة.
املأ الأنبوب إلى الأعلى بمخزن البيض واقلبه عدة مرات. بعد تكوير الأكاذيب ، تستنشق الديدان وتتخلص من sup natant. ثم اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام عازلة البيض.
بعد الغسيل ، يعلق ريس الحبيبات في خمسة ملليلتر من الماء ، متبوعا بإضافة خمسة ملليلتر من المعقم. 60٪ سكروز في الماء يخلط جيدا. بعد تكوير المعلق ، سيكون البيض في الغضروف المفصلي ويبدو غائما.
انقل كل مجموعة بيض إلى صفيحة NGM Agar غير المصنفة التي يبلغ طولها 10 سم يمكن استخدام الماء لشطف X على الطبق ، ولكن حاول تقليل كمية السوائل المنقولة. احتضن الأطباق طوال الليل عند 20 درجة مئوية في الساعات القليلة الأولى. قم بتهوية الأطباق عن طريق ترك الأغطية مغلقة قليلا ، ولكن تأكد من تغطيتها طوال الليل.
بعد الفقس ، انقل اليرقات L إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مملوء بالريحان S. حبيبات L منها وإعادة تعليقها في الحد الأدنى من الريحان. ثم قسم كل مجموعة L one إلى لوحين أجار NGM مقاس 10 سم بذرة بكتيريا NA 22.
راقب الثقافات مرة أو مرتين يوميا. إذا كانوا في خطر الجوع. انقلها إلى أطباق NA 22 الطازجة قبل الجوع بينما اكتب N خطين للتجميع وتحرك معا مثل موجة بعيدا عن المناطق المستنفدة للطعام على هذه الأطباق ، وسوف ينضب الطعام تماما في غضون ساعات قليلة.
عندما تصل الديدان إلى العمر المطلوب ، تكون جاهزة للتلوين المناعي أو التصوير الحي لتركيب الديدان. للتصوير متحد البؤر. استخدم وسائط تركيب Antifa لضبط كثافتها على بضع مئات من الديدان لكل ميكرولتر.
مع الخبرة ، يمكن التعرف على هذه الكثافة من خلال تعكر التعليق. من الناحية المثالية ، سيتم تعبئة الديدان بكثافة على شريحة المجهر ، ولكن لا تتداخل بشكل مفرط. على الشريحة ، اصنع وسادة من 2٪ أروس في ريحان ESP محاطة بحلقة رقيقة من الفازلين.
لمنع التبخر أثناء التصوير ، ضع الفازلين عبر حقنة سعة ثلاثة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 25. الآن قم بوضع بضعة ميكرولترات من تعليق الدودة على زلة غطاء باستخدام طرف ماصة مع قطع النهاية لمنع قص الديدان وخفض وسادة الورد الزراعي على زلة الغطاء ، ونشر الديدان بالتساوي على الوسادة تحت المجهر. يجب توجيه نقاط الاشتباك العصبي ذات الأهمية للإشارة مباشرة نحو أو في حدود 45 درجة من العدسة فقط.
اقض بضع ثوان في هذا لتجنب تبييض الصورة. يجب أن توفر الثقافة والظروف ما يكفي من الديدان لتلبية هذا المعيار الصارم الموضح هنا كاتجاه مثالي مع الحبل البطني الموجه مباشرة نحو العدسة الموضوعية. سيتم رفض هذا التالي لأن الحبل البطني موجه مباشرة بعيدا عن العدسة الشيئية.
لاحظ كيف ينتج الحبل الظهري الموجه نحو العدسة في هذه العينة صورة أكثر وضوحا. إليك واحدة أخرى سيتم رفضها لأن الحبال الظهرية والبطنية موجهة عند حواف الدودة. لذلك يجب أن يمر ضوء الإثارة والانبعاث عبر المزيد من الأنسجة الدودية وسيصبح مشوها.
يتمثل التحدي الرئيسي في تقليل التباين داخل مجموعات العلاج ، والتزامن العمري ، ويمكن أن يساعد اختيار الديدان حيث يتم توجيه بنية الاهتمام مباشرة نحو العدسة الموضوعية كثيرا. البدء بالثقافات الكبيرة يزيد من اختيارك للديدان لتحقيق أقصى قدر من الاتساق. للحصول على أفضل نتائج التصوير، اختر عينات مسطحة نسبيا يمكن تضمينها داخل كومة من 14 أو أقل.
أقسام سميكة 0.4 ميكرون. الصور عالية السرعة والدقة المنخفضة كافية لجمع البيانات بدقة السرعة. تجنب تشبع الكاشف بقوة إشارة مفرطة لأن ذلك سيؤدي إلى التقليل من شأن إشارات التألق.
يستخدم هذا العرض التوضيحي سرعة حزمة البرامج المتاحة تجاريا ، والتي يجب أن تكون على الأقل الإصدار 4.0. تفقد العديد من خيارات البرامج البديلة معلومات ثلاثية الأبعاد. بعد فتح ملفات الإخراج متعددة tiff من المجهر متحد البؤر ، حدد الصورة ، ثم التركيز الموسع ، ثم يدويا.
يقومعائد الاستثمار الآن بقص مناطق الصورة التي لا تحتوي على بنية الاهتمام. باستخدام الأداة التي تم تنشيطها ، يوفر التركيز البؤري الموسع إسقاطا على مستوى Z لتسهيل اختيار عائد الاستثمار. هذا لا يؤثر على البيانات الأساسية.
وبالمثل ، لا تؤثر تعديلات السطوع والتباين على البيانات الأساسية. قم بإنهاء الاقتصاص عن طريق تحديد الإجراءات والاقتصاص للتحديد. بعد ذلك ، قم بقياس طول المنطقة التي تم تحليلها.
باستخدام أداة الخط ، سيتم حساب طول السطر وإضافته إلى جدول البيانات. الآن ، حدد الكائنات باستخدام الكائنات حسب مرشح الشدة في وضع القياسات. قد يساعد تضمين علامة متشابكة مستقلة مصنفة بلون فريد في تحديد نقاط الاشتباك العصبي بشكل لا لبس فيه ، وتحديد عتبة بحيث يتم تمييز المجموعات المشبكية وعدم تمييز الخلفية غير المشبكية.
افعل ذلك مرة واحدة فقط باستخدام عينة تحكم واستخدامها لجميع العينات اللاحقة ، وعتبة كل عينة على حدة أمر غير مقبول لأنه يقدم احتمالية تحيز المجرب. يتم تحديد الكائنات وجدولتها تلقائيا. تتراوح نقاط الاشتباك العصبي النموذجية من بضع إلى بضع مئات من الفوكسل قبل تصدير البيانات ، فرز البيانات حسب حجم الكائن.
هذا يسهل إزالة الكائنات النهائية من اثنين أو أقل من فوكسل ، والتي عادة ما تكون مجرد مواصفات خلفية. الآن ، قم بتصدير البيانات بتنسيقات CSV ، والتي يمكن فتحها بواسطة أي برنامج جداول بيانات. تنتج كل صورة ملف إخراج واحد لفرز وتصدير الصور المجهرية للحبل العصبي البطني CL gans الذي يظهر على 49 مستقبلا من مستقبلات GABA تم إنتاجها باستخدام البروتوكول الموصوف.
بدت جميع متشابهة جدا في الحجم والنضج. تم تطبيع إجمالي قيم التألق المشبكي لخمس ديدان ، لذلك تم تحليل طول الحبل العصبي. أظهرت هذه البيانات قيم خطأ قياسية تبلغ حوالي 10٪ من المتوسط.
الصورة الموجودة على اليسار خام بدون إزالة مواصفات العتبة والخلفية. تم التعامل مع نقاط الاشتباك العصبي مع موس كارمال ، وهو مؤثر مستقبلات GABA الذي يتسبب في تقليل التنظيم للمستقبلات بعد التعرض لفترة طويلة. تم قياس التألق الكلي وتطبيعه إلى الاحتمال التراكمي لطول الحبل العصبي.
تم حساب الرسوم البيانية للأفراد محتوى مضان المشبك. تم حساب الشيء نفسه لحجم المشبع. تظهر هذه القياسات أن التعرض للناهض يقلل بشكل كبير من المحتوى المشبكي والحجم.
بشكلعام ، يجب أن تعكس النتائج الكمية دائما ما يمكن تقديره بصريا. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب أن يكشف فحص الصور والأجسام المحددة بالسرعة عن مكان حدوث الخطأ ويقترح إجراء تصحيحيا مثل تحديد عتبة أو إزالة القطع الأثرية أثناء محاولة هذا الإجراء. من الأهمية بمكان اختيار الديدان للتصوير بناء على كيفية توجيهها هندسيا بدلا من التقييم الذاتي لجودة الصورة حيث يمكن أن يكون ذلك ممكنا ، يوصى بشدة بالتسجيل الأعمى.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقوم هذه الطريقة بتحديد كميات مستقبلات الناقل العصبي المضيئة في ثلاثة أبعاد بدقة تقدر بمشبك واحد في C. elegans. وتتيح هذه الطريقة تحديد خصائص مئات المشابك العصبية في عينة واحدة بسرعة، مع تقليل التشوهات الناتجة عن إسقاط المستوى العمودي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- علم الأحياء الخلوي
الخلفية
- تلعب مستقبلات الناقل العصبي دورًا حاسمًا في قوة المشابك العصبية.
- يمكن أن يوفر فهم توزيع المستقبلات نظرة ثاقبة حول وظيفة المشابك العصبية.
- يتيح التصنيف الفلوري التصوير التفصيلي للمشابك العصبية.
- يعتبر C. elegans كائنًا نموذجيًا لدراسة الآليات المشبكية.
غرض الدراسة
- تحديد أبعاد وسطوع الإشارات الفلورية في المشابك العصبية بكفاءة.
- تحليل مجموعات كبيرة من البروتينات المشبكية.
- تقليل التباين في نتائج التصوير.
الطرق المستخدمة
- توليد ثقافات متزامنة عالية الكثافة من C. elegans.
- الحصول على صور مجسمة للوصلات العصبية المضيئة.
- تحديد النقاط المشبكية تلقائيًا من الخلفية الفلورية.
- تحديد كمية المستقبلات في كل مشبك عصبي.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح للبروتين المشبكي مع تقليل التباين.
- تحديد كمية مجموعات مستقبلات الناقل العصبي في المشابك العصبية.
- تحديد خصائص مئات المشابك العصبية في عينة واحدة.
- رؤى حول العلاقة بين كمية المستقبلات وقوة المشبك العصبي.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة أداة قوية لدراسة بيولوجيا المشابك العصبية.
- يمكن للتحليل الكمي تعزيز فهم الآليات المشبكية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة في مختلف التحقيقات المشبكية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying synaptic receptor abundance in C. elegans enables mechanistic de-risking of target validation in neuroscience drug discovery by providing high-content, statistically robust data on postsynaptic protein localization. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking receptor dynamics to functional synaptic strength, informing portfolio triage for CNS-targeted therapeutics. The method’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery biology and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying receptor clustering at synapses, clarifying pathway engagement and biological de-risking.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated, high-throughput analysis of synaptic puncta, reducing variability in mechanistic assays.
- Predictive Value: Generates quantitative fluorescence and volume data per synapse, enhancing predictive confidence in target modulation and portfolio prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing synaptic protein quantification across large synapse populations.
- Reproducibility: Ensures assay standardization through automated 3D identification of synapses, minimizing z-projection artifacts and enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Processes hundreds to thousands of synapses per sample, supporting platform reuse and high-content screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant system alignment by quantifying natively localized synaptic proteins in intact C. elegans, supporting biomarker alignment.
- Preclinical De-risking: Connects discovery-phase receptor dynamics to preclinical validation by characterizing agonist-induced changes in synaptic content and volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing statistically powered data on synaptic protein distribution under experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates across the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic de-risking in preclinical stages by delivering quantitative, spatially resolved synaptic data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying receptor abundance and localization at single-synapse resolution.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible, automated identification of synaptic puncta, ensuring quantitative outputs for compound screening.
- Analytics: Delivers fluorescence intensity, volume, and total fluorescence measurements per synapse, enabling statistical comparison of conditions and readout standardization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by characterizing synaptic changes in intact organisms, supporting biomarker alignment and disease-relevant system validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for quantifying any punctate fluorescence signal, adaptable across model systems and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through quantitative synaptic protein analysis.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via automated 3D synapse identification and data tabulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk by enabling data-driven target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through large-scale, statistically robust synaptic datasets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, image analysis, and C. elegans handling for synchronized culture preparation.
- Depends on instrumentation capable of multi-plane confocal imaging and software supporting 3D object identification (e.g., Velocity ≥4.0).
- Necessitates cross-team standardization of worm orientation, age synchronization, and imaging parameters to minimize inter-animal variability.
- Requires adaptation considerations when applying to non-C. elegans systems or non-synaptic puncta, particularly regarding thresholding and ROI selection.
- Practical limitations include the need to avoid detector saturation and ensure proper worm orientation to maintain signal fidelity, as supported by source material.
