نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

الضامة تلعب دورا محوريا في التوازن وعلم الأمراض في العديد من الأنسجة. بروتوكول المقدمة هنا يصف أساليب لاستنزاف الضامة

الهدف من التجربة التالية هو تحديد دور البلاعم المستقطبة في عملية بيولوجية في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنفاد البلاعم أولا من الفئران. بعد ذلك ، يتم إنشاء البلاعم الجديدة ، التي تعبر عن ميزات فريدة ولها وظائف مميزة.

ثم يتم نقل البلاعم المستقطبة بالتبني إلى الفئران لتحديد دورها في العملية البيولوجية ذات الأهمية. في النهاية ، يمكن قياس الاختلافات في الالتهاب بوساطة البلاعم بناء على الأمراض السريرية والنسيجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل عبور الفئران على خلفية CD 11 BDTR هي أن هذه الطريقة أسرع من تربية الفئران.

للتجارب. إنه سهل نسبيا وفعال من حيث التكلفة ويمكن إجراؤه مع الفئران من أي خلفية وراثية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدور البلاعم في الأمعاء ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مجموعة متنوعة من الأعضاء الأخرى ، بما في ذلك الكبد والطحال والرئة.

قبل الحقن بساعتين ، قم بإزالة أنابيب الجسيمات الشحمية و PBS من تخزين أربع درجات مئوية. عندما تصل الجسيمات الشحمية إلى درجة حرارة الغرفة ، اقلب الأنابيب من ثماني إلى 10 مرات لضمان التوزيع المتساوي. ثم قم بتحميل 200 ميكرولتر من التعليق الدافئ إلى الجسيم الليبويني في حقنة سعة مليلتر واحد وقم بإرفاق إبرة قياس 26.

لف المحقنة بين راحتي كلتا يديك واقلبها ست مرات لتوزيع محلول الجسيم الشحمي بالتساوي قبل الحقن. استخدم الآن إحدى يديك للقذف ، فأر أسفل الأذنين مباشرة ، ممسكا بجلد كاف لشل حركة رأسه وأطرافه ، ثم قم بإمالة الماوس بحيث يكون رأسه قليلا نحو الأرض. ثم أمسك المحقنة بزاوية 30 إلى 40 درجة.

أدخل الإبرة في الربع الأيمن السفلي من البطن وحقن 200 ميكرولتر من محلول الجسيمات الشحمية. بعد القتل الرحيم لفأر يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعا وربط الأطراف في وضع ممتد ، قم بإزالة عظم الفخذ والظنبوب لقطع أكبر قدر ممكن من العضلات أثناء عملية التشريح. ثم قم بتحميل حقنة سعة خمسة ملليلتر مع IMDM مع 10٪ FCS.

قم بتوصيل إبرة قياس 26 وشطف النخاع من العظام. قم بتخفيف نخاع العظم الذي يستنشق في 40 مل من IMDM باستخدام FCS ، ثم انقل الخلايا إلى قارورة ثقافة الأنسجة بحجم 75 سم مربع. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد أربع ساعات.

اجمع السوبينات في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للأسلاف غير الملتصقة لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G ودرجة حرارة الغرفة. بعد العد ، قم بزراعة الخلايا المستردة بتركيز 0.5 في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر في وسط كامل في قوارير جديدة 75 سم مربع. في اليوم الرابع ، قم بتدوير خلايا عدم الالتصاق وأعدها إلى القوارير في وسائط جديدة.

في اليوم السابع ، تخلص من خلايا عدم الالتصاق ، واستبدلها بوسائط جديدة. في اليوم 10 ، تجاهل وسائل الإعلام. ثم أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا إلى القارورة.

بعد خمس دقائق ، اضرب جانب القارورة بقوة بكعب راحة يد واحدة عدة مرات. افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها رفعت الجزء السفلي من القارورة. ثم قم بعمل ماصة الخلايا المعلقة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

اغسل القارورة ب 10 ملليلتر إضافية من IMDM plus FCS ، ثم قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 300 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة. بعد العد ، أعد تعليق الخلايا المستردة بتركيز 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في PBS المعقم مع الاحتفاظ بواحد في 10 إلى البلاعم الستة لتقييمات النمط الظاهري للبلاعم تبدأ بتجهيز حقنة مليلتر واحد مملوءة ب 100 ميكرولتر في تعليق البلاعم المعد للتو بإبرة قياس 26. بعد ذلك ، استخدم الماوس الأكثر دفئا مصباحا حراريا لمدة خمس إلى 10 دقائق لتوسيع الوريد الذيل.

بعد نقل الماوس إلى جهاز تقييد ، قم بتدوير الذيل 90 درجة بحيث يكون الوريد متجها لأعلى. نظف موقع الحقن بمسحة كحولية ثم أمسك الإبرة بحيث يكون الجانب المائل متجها لأعلى. وبزاوية طفيفة ، أدخل الإبرة بالتوازي تقريبا مع الوريد.

إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح ، فلا ينبغي الشعور بأي مقاومة ويجب أن يصبح الوريد واضحا بعد الحقن بعد الحقن ، واضغط برفق على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. توضح هذه الأقسام الكيميائية المناعية لقولون الفأر أن الحقن داخل الصفاق للجسيمات الشحمية المحتوية على كلودرونات يؤدي إلى انخفاض في F أربعة 80 ضامة إيجابية أثناء التهاب القولون الناجم عن DSS كما يتضح من الانخفاض في F أربعة 80 تلطيخ باللون البني مقارنة بالفئران المحقونة PBS الأرجيناز المثبت واحد. بدلا من ذلك ، يتم أيضا استنفاد البلاعم المنشطة باللون البني بنجاح باستخدام حقن الجسيمات الشحمية كلودرونات

تمثل البقعة الزرقاء في هذا الشكل والشكل السابق النوى حيث يظهر الرسم البياني الشريطي تقييما كميا ل F أربعة 80 ضامة مشتقة من MCSF إيجابية وأرجيناز واحد إيجابي. بدلا من ذلك ، يشير MCSF المنشط المشتق بالإضافة إلى IL أربعة ضامة معالجة إلى أن كلا المجموعتين مستنفدان بشكل كبير في الفئران التي تتلقى حقنا داخل الصفاق من الجسيمات الشحمية كلودرونات توضح هذه البيانات النتائج من مقايسة الشحوم النموذجية ، والتي تقيس مستويات أكسيد النيتريك استجابة لعديدات السكاريد الدهنية عن طريق الكشف عن مستقلب النتريت في اتجاه مجرى النهر.

وبالتالي ، تنتج البلاعم المشتقة من MCSF المنشطة بشكل كلاسيكي مستويات أعلى بكثير من النتريت مقارنة ب MCSF المنشط بدلا من المشتقة بالإضافة إلى IL أربعة ضامة معالجة. تنتج البلاعم المنشطة كلاسيكيا أيضا نسبة IL 12 P 70 إلى IL 10 أعلى مقارنة بالبلاعم التي يتم تنشيطها بدلا من ذلك كما تم قياسها بواسطة ELA بما يتوافق مع النمط الظاهري المنشط بدلا من ذلك. البلاعم المشتقة من MCSF المعالجة ب IL أربعة تعبر بشكل أساسي عن YM واحد وأرجيناز واحد كما تم اكتشافه بواسطة الخيط المناعي الغربي.

هنا ، يتم عرض العدد الإجمالي للضامة M1 التي يتم تنشيطها كلاسيكيا وعدد M اثنين من الضامة التي تم تنشيطها بدلا من ذلك في الأقسام النسيجية من الفئران التي تم حقنها بالضامة المشتقة من نخاع العظم المستقطب. يشير شريط البيانات C إلى الفئران الضابطة التي تلقت حقنة PBS بدون ضامة. يشار إلى تأثير نقل البلاعم المستقطبة على القولون أثناء التهاب القولون الناجم عن DSS من خلال مؤشر نشاط المرض ، وهي درجة مضافة تعتمد على فقدان الوزن ونزيف المستقيم وانخفاض تناسق البراز.

لاحظ أن البلاعم M1 لا تؤثر على الالتهاب ، في حين أن M اثنين من الضامة تقلل بشكل كبير من مؤشر نشاط المرض. لذلك ، تظهر هذه النتائج أن الضامة المنقولة بالتبني المشتقة من dex vivo يمكن أن تنتقل إلى القولون وتؤثر على الالتهاب الناجم بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الذين يدرسون بيولوجيا البلاعم لاستكشاف دور استقطاب البلاعم في الفئران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد دور الضامة المستقطبة في التوازن وفي الأمراض في الفئران.