قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

تُنتج هذه التقنية القياسية شرائح غطاء مطلية بـ gelatin ووسومة فلورية، وهي مناسبة لمقايسات التحلل الكمي لمصفوفة الـ invadopodia. بعد طلاء شرائح الغطاء بـ gelatin موسوم فلورياً، يتم استزراع الخلايا وتنميتها لتحلل المصفوفة. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا وصبغها فلورياً لبروتينات مؤشرات الـ invadopodia، ثم يتم التقاط الصور وقياس تحلل المصفوفة كمياً.

يمكن للنتائج النموذجية أن تحدد كمياً الفروقات في تحلل المصفوفة بوساطة podia بين الخلايا التي خضعت لمعالجات متباينة لجينات مختارة أو المعالجة بعوامل دوائية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تحضير شرائح غطاء مطلية بالجيلاتين بفلورة متجانسة بسبب الطلاء غير المتساوي للجيلاتين الفلوري أو التعامل غير الصحيح مع شرائح الغطاء المطلية بالجيلاتين. ستقوم أستاذة المساعد في البحوث Karen Martin، وباحثة ما بعد الدكتوراه Mandy Ammer، وطلاب الدراسات العليا Elise Walk وKaren Hayes وSteve Markwell بشرح هذا الإجراء.

لتحضير المحلول المخزون غير المسمى من سكر السكروز والجيلاتين بتركيز 5%، اخلط الجيلاتين والسكروز في محلول PBS وأذبهما تماماً عند 37 درجة مئوية. ثم يُحفظ المحلول عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. انتقل بعد ذلك إلى تنظيف أغطية الشرائح الزجاجية.

وزع غطاء شريحة فردي في كل بئر من ألواح زراعة الأنسجة البلاستيكية المكونة من 24 بئراً، وأضف 500 microliters من حمض النيتريك بتركيز 20% إلى كل بئر ثم حضنها لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة محلول حمض النيتريك، اغسل أغطية الشرائح ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك قم بالطلاء.

يُوضع على كل شريحة غطاء 500 µL من البولي لايسين بتركيز 50 µg/mL، وتُحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يُزال محلول البولي لايسين وتُغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS. يُسهل طلاء البولي لايسين (Poly L lysine) عملية التغطية والربط المتجانس للجيلاتين المسمى الذي يوضع فوقه. تُوضع أطباق الـ 24 بئراً على الثلج ويُضاف 500 µL من الغلوتارالدهيد بتركيز 0.5% المحضر حديثاً إلى كل بئر.

يتم تحضين الأطباق على الثلج لمدة 15 دقيقة. تُجرى ثلاث عمليات غسل باستخدام PBS بارد، ثم يتم سحب جميع آثار PBS قبل عملية الطلاء بالجيلاتين. وفي هذه الأثناء، وأثناء فترة التحضين باستخدام الغلوتارالدهيد، يتم إعادة تشكيل الجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 4 88.

وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، يتم تدفئة المحلول ومحلول الجيلاتين والسكروز المخزون بتركيز 5% غير المعلم إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تخفيف 500 µL من الجيلاتين المعلم في 4 mL من الجيلاتين غير المعلم والسكروز. ثم يتم نقل 100 µL من خليط الجيلاتين 4 88 المخفف إلى كل شريحة غطاء.

استخدام كمية كافية من الجيلاتين لتغطية شريحة الغطاء دون الحاجة إلى التوزيع اليدوي. من المهم الحفاظ على خليط جيلاتين 4 88 المخفف عند درجة حرارة 37 درجة خلال عملية التغطية لمنع التصلب المبكر. كما يجب، بدءاً من هذه الخطوة، الاحتفاظ بشرائح الغطاء في الظلام قدر الإمكان لتجنب حدوث التبييض الضوئي المحتمل.

بمجرد تغطية جميع شرائح الغطاء في لوحة واحدة، أمسك اللوحة بزاوية وقم بإزالة الجيلاتين الزائد من كل بئر عن طريق الشفط بالتفريغ. ثم قم بحضن شرائح الغطاء المطلية في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل شرائح الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS، أضف 500 µL من بوروهيدريد الصوديوم.

يكون بوروهيدريد الصوديوم فواراً، وستظهر فقاعات صغيرة على وحول كل شريحة غطاء؛ يتم التحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاختزال وتعطيل بقايا الغلوتارالدهيد. يتم إزالة محلول بوروهيدريد الصوديوم عن طريق الشفط بالتفريغ بحركة مسح سريعة حول الجزء الخارجي من كل بئر، مع الحرص على عدم سحب أي شرائح غطاء عائمة قد انفصلت عن قاع طبق زراعة الأنسجة أثناء المعالجة ببوروهيدريد الصوديوم. بعد ثلاث غسلات بمحلول PBS، يتم تحضين شرائح الغطاء في إيثانول بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام تقنية التعقيم، انقل شريحة التغطية التي تحتوي على الصفائح إلى غطاء تدفق صفائحي لزراعة الخلايا من النوع الثاني B، واشطف شرائح التغطية ثلاث مرات باستخدام PBS معقم بواسطة إبرة وملقط معقمين. انقل شرائح التغطية بعناية إلى بئر فارغ في لوحة جديدة مكونة من 24 بئرًا، وقم بموازنة شرائح التغطية مع الوسط الزرعي الخاص بنوع الخلايا المحدد المستخدم في العملية.

الآن، قم بزراعة الخلايا مباشرة على شرائح التغطية بعد فترة حضانة مناسبة. قم بمعالجة العينات للتصوير المناعي الفلوري من أجل تثبيت العينات. ضع قطرة من prolonged gold anti fade أو كاشف مشابه على شريحة مجهرية وقم بوضع شريحة التغطية المقلوبة بعناية، ثم التقط الصور اللازمة للتحليل.

يوفر هذا التحليل المساحة المعيرة لتدهور المصفوفة بالنسبة لمساحة الخلايا أو عددها. وهو مفيد لتحليل المجالات المجهرية الكاملة التي تتواجد فيها خلايا متعددة تمت معالجتها بشكل جماعي بعوامل نمو irna أو عوامل علاجية. ولإجراء هذا التحليل، يتم جمع الصور بتكبير منخفض يكون كافياً لجمع معلومات عن مجموعات الخلايا بكفاءة.

افتح الصورة في برنامج ImageJ. تحقق من معلومات المقياس وحدد القياسات. اختر خياري المساحة والحد الأدنى للعتبة (threshold). احسب مساحة التحلل باستخدام صورة الجيلاتين الفلورية، مع تصحيح الإضاءة غير المنتظمة عبر الجيلاتين عن طريق طرح عتبة الخلفية، ثم استخدم الصورة لتعيين قيم شدة البكسل العليا والسفلى.

في الصور اللاحقة، استخدم زر "set" في نافذة العتبة (threshold) لتعيين العتبة ذاتها لجميع الصور كوسيلة موضوعية لتحديد منطقة التحلل. استخدم وظيفة "analyze particles" لقياس العتبة في مناطق تحلل المصفوفة.

اختر حجماً للجزيئات أكبر من صفر لإزالة الضجيج من التحديد. قم بتفعيل إظهار المخططات لتحديد المناطق ذات الأهمية. ثم حدد خياري عرض النتائج والتلخيص لإظهار القياسات إذا كان الرسم قد حدد بدقة جميع مناطق التدهور.

انسخ قياس المساحة الإجمالية في جدول بيانات؛ وفي حال تم تحديد أجسام أخرى، مثل الحطام، قم بتسجيل مساحات المناطق ذات الصلة فقط. بعد ذلك، ولحساب مساحة الخلية، افتح صورة foid والصورة المصبوغة ثم حدد عتبة الصورة لضبط قيم كثافة البكسل العليا والسفلى لضمان تحديد حواف الخلايا في الصور اللاحقة. استخدم زر "set" في نافذة العتبة لتعيين العتبة ذاتها لجميع الصور.

كوسيلة موضوعية لتحديد منطقة الخلايا، استخدم وظيفة تحليل الجسيمات (analyze particles) لقياس حد مساحة الخلايا. اختر حجماً للجسيمات أكبر من صفر لإزالة الضوضاء من عملية التحديد.

اعرض المخططات التفصيلية لتحديد المناطق المراد تحليلها، ثم تحقق من نتائج العرض ولخصها لعرض قياسات المساحة. لا تفعّل خيار التحقق. قم بتضمين الفجوات في حال وجود مسافات بين الخلايا والتجمع.

الآن اختر. حسناً، انسخ نتائج المساحة للمناطق ذات الصلة بالاهتمام في جدول بيانات واحسب مساحة تحلل الجيلاتين بالنسبة للمساحة الكلية للخلايا. وهناك نهج بديل يتمثل في معايرة مساحة التحلل وفقاً لعدد الخلايا الذي يتم تحديده عن طريق عد النوى المصبوغة بـ DAP e.

يُعد هذا الأمر مهماً إذا أدت عمليات المعالجة إلى تغيير متوسط مساحة الخلية. لهذا النهج، استخدم ملحق عدّ النوى (nucleus counter plugin) لعدّ النوى تلقائياً. قم بضبط الخيارات لتحسين النتائج بما يتناسب مع صورك. وفي حال تداخل النوى بشكل كبير، قد لا يوفر العدّ التلقائي حصراً دقيقاً في هذه الحالة.

يمكن تسهيل العد اليدوي باستخدام ملحق عد الخلايا عند تنفيذه بشكل صحيح. تُطلى شرائح التغطية بالتساوي بـ gelatin المقترن بـ Oregon Green 4 88. يمكن أن تظهر عدة شوائب اصطناعية أثناء طلاء ومعالجة شرائح التغطية المطلية بـ gelatin.

على سبيل المثال، ينتج الطلاء غير المتساوي عن التغطية غير الصحيحة لشريحة الغطاء أثناء عملية الطلاء بسبب سوء الخلط، أو الفرد اليدوي، أو التصلب الجزئي لخليط الجيلاتين. وتشير الخدوش إلى إزالة المصفوفة المطلية عن طريق الخدش بالإبر أو الملاقط أثناء المناولة. كما يمكن أن يؤدي جفاف سطح شريحة الغطاء خلال فترات التخزين الطويلة إلى ظهور مظهر يشبه رصف الطرق. وتعكس هذه المنطقة حدوث تبييض ضوئي لسطح الجيلاتين الفلوري أثناء التصوير بسبب التعرض للضوء لفترة طويلة أو بكثافة عالية.

لاحظ كيف تظهر شريحة التغطية المُعدة جيداً فلورة متجانسة عند فحصها بالمجهر. توفر المصفوفات الرقيقة الناتجة عن هذا الإجراء وسيلة حساسة لتقييم قدرة الخلايا على تفكيك المصفوفة خارج الخلوية (ECM). على سبيل المثال.

تظهر هذه الصور نشاط تحلل مصفوفة القمة الغازية لخلية سرطان الرأس والعنق من نوع OSC 19. هنا، تم زرع الخلايا على شريحة غطاء من الجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 488 وتم تصويرها بواسطة المجهر الفلوري، كما هو موضح في الصور ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D). وقد تم وسم خلايا OSC 19 المزروعة على شرائح غطاء الجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 488 باستخدام Phalloidin المقترن بـ Rhodamine وأجسام مضادة لـ cort actin، والتي تم إظهارها باستخدام جسم مضاد ثانوي من نوع Alexa Fluor 647، مع تلوين المناطق الغازية باللون الأخضر اصطناعياً.

تظهر الأقدام الكاذبة (Podia) في الصورة المدمجة على شكل تركيزات سيتوبلازمية بؤرية من F actin و cortan تتداخل مع مناطق تطهير الجيلاتين. يوضح التصوير كيفية اختراق الأقدام الكاذبة الغازية في الحجم الفرعي لـ ECMA؛ وقد تم إنشاء هذا العرض لإظهار حافة داخل الخلية حيث توجد الأقدام الكاذبة الغازية. كما يوضح عرض الحافة الظهرية الأقدام الكاذبة الغازية وهي منغرسة في الجيلاتين الموجود بالأسفل.

يُظهر عرض الحافة البطنية البروز في أقدام Veda ومناطق تحلل الجيلاتين تحت غطاء الشريحة، حيث تظهر المناطق الحمراء المصفوفة الخضراء. تعرض هذه الصور بعض الخطوات الهامة لكمية تحلل مصفوفة الجيلاتين المعيارية للخلايا ضمن صورة مجهرية كاملة. وقد تم تحويل جميع الصور الفلورية إلى التدرج الرمادي لعرض تحديد العتبة الحمراء وعلامات منطقة الاهتمام بشكل أفضل.

تُظهر هذه الصورة للجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 488 المناطق الداكنة التي حدث فيها التحلل. ومن خلال عملية تحديد العتبة (Thresholding)، تُبرز صورة الجيلاتين مناطق التحلل التي يتم من خلالها قياس مناطق اهتمام مختارة لتحديد مساحة التحلل. وتُظهر هذه الصورة الـ rumine و foid وصبغ f actin كما هو متوقع.

توضح عتبة صورة الأكتين إجمالي مساحة الخلية التي يتم من خلالها اختيار مناطق الخلية المراد قياسها. وبالمثل، يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة صور أنوية الخلايا المصبوغة بـ DAPI. تعرض هذه اللوحة خطوات مختارة تهدف إلى قياس تحلل الجيلاتين الفلوري بواسطة خلايا فردية ضمن مجموعة خلوية مختلطة.

هذا التحديد الكمي البسيط لخلية واحدة من خلايا OSC 19 مُحوَّلة تعبر بشكل مفرط عن بروتين cort actin المؤتلف المدمج مع علامة epitope flag. لاحظ كيف يمكن أيضاً تحليل تحلل المصفوفة بواسطة الخلايا المُحوَّلة ضمن مجموعة مختلطة من الخلايا المُحوَّلة وغير المُحوَّلة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدة أمور.

أولاً، تأكد من أن الواسمات الخلوية الفلورية لا تتداخل مع لون الجيلاتين الفلوري. وعند جمع الصور، من المهم اختيار الحقول بناءً على وجود الخلايا. لا تبحث بشكل تفضيلي عن مناطق التحلل، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحيز البيانات نظراً للتفاوت بين الخطوط الخلوية والاستجابات لمختلف العوامل العلاجية.

يجب تحسين عوامل مثل وقت تحلل عدد المقاعد واختيار البروتين للوسم المناعي الفلوري بما يتناسب مع تجربتك الخاصة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج شرائح غطاء مغطاة بشكل متساوٍ بالجيلاتين الفلوري من فحوصات التحلل التي تتوسطها beta podia، بالإضافة إلى طرق تقدير كمية تحلل المصفوفة.