Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس طوبولوجيا التصاق الخلية على الركيزة بدقة نانومتر. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا أولا على شرائح زجاجية شفافة واحتضانها بعلامة الفلورسنت. ثم تتم معايرة الموضع الزاوي لمرآة المجهر القابلة للتعديل ويتم تخزين الموضع في برنامج تحديد موضع المرآة.

الخطوة التالية هي تسجيل الصور الفلورية عند التشعيع في حوالي 10 زوايا مختلفة. الخطوة الأخيرة هي حساب مسافات ركيزة الخلية بدقة بضعة نانومترات. في النهاية ، يتم استخدام نتائج طوبولوجيا التصاق الخلية على الركيزة لإظهار الاختلافات في الالتصاق بين خطوط الخلايا المختلفة ، على سبيل المثال ، الخلايا السرطانية والخلايا الأقل خبيثة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، هي أن الدقة الفعلية في حدود بضعة نانومترات فقط. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأغشية الخلايا. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الحويصلات الصغيرة أو المواد النانوية.

سيظهر التجربة ما بعد الدكتوراه بترا ، الذي سيقوم بإعداد عينات الخلية ومهندسنا ، مايكل فاغنر ، الذي سيقوم بإجراء التجربة لإعداد الخلايا لزاوية متغيرة ، انعكاس داخلي كلي. يقوم الفحص المجهري الفلوري ببذور الخلايا الفردية بكثافة 100 خلية لكل ملليمتر مربع على شريحة زجاجية في وسط مزرعة مكملة بنسبة 10٪ من عجل الجنين والمصل والمضادات الحيوية. تنمو الخلايا لمدة 72 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، قم بتطبيق الغشاء الفلوري على الخلايا ، أو العلامة ستة D ، أو ديكانو اثنين ، أو ثنائي ميثيل أمينو النفثالين ، أو لوران بتركيز ثمانية ميكرومولار في الثقافة ، واحتضان متوسط لمدة 60 دقيقة قبل الفحص المجهري الفلوري. اغسل الخلايا بماصة PBS ، وقم بإزالة المحلول العازل فوق شريحة الكائن لإزالة الوسيط بعد ذلك ، وامسح محلول المخزن المؤقت من الجانب الخلفي لشريحة الكائن. يتم استخدام مجهر عمودي مثل خطة Zeiss Axio ، المجهز بكاميرا خلفية مضاءة و / أو كاميرا EXON E-M-C-C-D لزاوية متغيرة.

T-I-R-F-M استبدل المكثف الخاص به بجهاز إضاءة مخصص بمنشور زجاجي أسطواني نصف مقترن بصريا بشريحة الكائن. يسقط شعاع الليزر من ألياف أحادية الوضع مجمعة ، والتي بعد التصوير بواسطة المنشور الزجاجي والمكونات البصرية الإضافية ، تؤدي مرة أخرى إلى شعاع متوازي على سطح العينة. احرص على أن يكون متجه المجال الكهربائي مستقطبا ، عموديا على مستوى الحوادث.

يتم وضع علامة على هذا الموضع على مقرنة الإخراج للألياف. استخدم مرآة قابلة للتعديل موجودة داخل المكثف ، والتي يتم تصويرها في مستوى العينة وتضيء العينة تحت زاوية متغيرة من الحوادث أو شعاع الجسم. يمكن تشغيل المرآة القابلة للتعديل بواسطة محرك متدرج يتم التحكم فيه بواسطة البرنامج.

يتوافق كل موضع مع زاوية محددة جيدا من الحوادث على النحو الذي تحدده قياسات متابعة مقياس go. لمعايرة الوضع الزاوي للمرآة القابلة للتعديل ، استخدم صبغة فلورية مثل نيوكليوتيد فلافين واحد مليمولار ، مذاب في الماء. لتصور الزاوية الحرجة عند تغير زاوية الحوادث ، استخدم الزاوية الحرجة البالغة 61.3 درجة لانتقال الماء الزجاجي كقيمة ثابتة ، حيث يتم تخزين الموضع الزاوي للمرآة التي تساوي عندها زاوية الحوادث الزاوية الحرجة في برنامج تحديد موضع المرآة.

باستخدام برنامج الكاميرا ، قم بتعيين معلمات كاميرا E-M-C-C-D ، بما في ذلك زيادة درجة الحرارة ووقت التسجيل وسرعة التحول. استخدم زيت الغمر لضمان الاتصال البصري للعينة. باستخدام منشور زجاجي ، حدد عدسة موضوعية ذات تكبير مناسب للخلايا وفتحة رقمية معتدلة.

لتصور الكائن في المجهر ، استخدم مرشحا مناسبا للتمرير الطويل أو التمرير النطاقي للكشف عن التألق. سجل صور مضان لعينات متطابقة عند اختلاف زاوية الإضاءة. يجب أن تكون زوايا الحوادث متماثلة أو أكبر من الزاوية الحرجة.

مع الزاوية الحرجة المقابلة ل 64.5 درجة لواجهة زجاجية الخلية ، يوصى بنطاق زاوي من 66 درجة إلى 74 درجة بخطوات 0.5 درجة أو درجة واحدة. لبدء تحليل البيانات ، استخدم برنامج عرض المختبر لقراءة الصور المسجلة في زوايا مختلفة بالإضافة إلى إعدادات الكاميرا والطول الموجي للإثارة ومؤشرات الانكسار. بالنسبة للزجاج ، وهو 1.52 ، والخلايا ، وهو 1.37 ، يتم استيراد الإعدادات للتقييم الصحيح للبيانات.

لكل مجموعة من المعلمات ، يتم حساب عمق الاختراق وعامل الإرسال تلقائيا لنجاح الإجراء. من المهم أن يتم تسجيل الصور بعناية واختيارها لتحليلها. حدد الصور المستخدمة لتقييم مسافات ركيزة الخلية وفقا للمعادلة.

بالنسبة لعلامة الغشاء ، قد يتم استبعاد الصور الفردية داخل الإضاءة المتجانسة ، كما هو موضح في هذا المثال. احسب صور طوبولوجيا ركيزة الخلية وحدد رمز اللون المناسب للعرض أثناء التقييم. يمكن عرض ملفات تعريف وحدات البكسل الفردية كما هو موضح في هذا الشكل.

يمكن استخدام هذه الملامح كمؤشر لجودة الملاءمة. أخيرا ، قم بتخزين بروتوكول التقييم. يصور هذا الشكل إجمالي صور الانعكاس الداخلي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U2 51 مجم مع جين مثبط للورم TP 53 المنشط.

عند الحضانة مع luan المسجلة في زوايا مختلفة من الحوادث ، 66 درجة المقابلة لعمق اختراق المجال الكهرومغناطيسي الزائل حوالي 140 نانومتر ، 69 درجة ، أي ما يعادل عمق اختراق 75 نانومتر و 73 درجة يتوافق مع عمق اختراق 60 نانومتر مع تناقص الاختراق. تقل شدة مضان العمق وتنشأ من مواقع أكثر سطحية للخلايا ، مثل جهات الاتصال البؤرية على حوافها. يتم تصوير مسافات ركيزة الخلية في اللوحة D بواسطة رمز ألوان يتراوح من صفر إلى 600 نانومتر كما هو موضح هنا.

تختلف مسافات ركيزة الخلية اختلافا كبيرا عبر الخلايا بين بضعة نانومتر فقط ممثلة بالأبيض إلى الأصفر و 250 إلى 300 نانومتر ممثلة باللون الأحمر الداكن. يشير هذا إلى أن جهات الاتصال البؤرية ومسافات ركيزة الخلية الأكبر في مكان قريب. يتم حساب تباين مماثل في مسافات ركيزة الخلية لخلايا الورم الأرومي الدبقي U2 51 مجم مع جين مثبط للورم المنشط P 10.

في المقابل ، تكون مسافات ركيزة الخلية ثابتة إلى حد ما لخلايا التحكم U2 51 مجم ممثلة بخلايا صفراء وبرية ممثلة بالبرتقالي إلى الأحمر بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طوبولوجيا الركيزة الخلوية لاستكشاف الخلايا السرطانية والتغيرات المورفولوجية عند العلاج بالليزر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور الأسطح بدقة فعلية في نطاق النانومتر عند التعرض للضوء المنخفض ، وهو أمر مقبول جيدا للكائنات الحية.