Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تضاريس التصاق الخلايا على ركيزة بدقة نانومترية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة الخلايا على شرائح زجاجية شفافة وحضنها مع وسم فلوري. ثم يتم معايرة الموضع الزاوي لمرآة المجهر القابلة للتعديل وتخزين هذا الموضع في برنامج تحديد موضع المرآة.

تتمثل الخطوة التالية في تسجيل صور الفلورة عند التشعيع من حوالي 10 زوايا مختلفة. والخطوة النهائية هي حساب المسافات بين الخلايا والركيزة بدقة تصل إلى بضعة نانومترات. وفي نهاية المطاف، تُستخدم نتائج طبوغرافية التصاق الخلايا بالركيزة لإظهار الاختلافات في الالتصاق بين الخطوط الخلوية المختلفة، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية والخلايا الأقل خباثة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر البؤري (confocal microscopy)، في أن الدقة الفعلية تقع في نطاق بضعة نانومترات فقط. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الأغشية الخلوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الحويصلات الصغيرة أو المواد النانوية.

ستقوم الباحثة في مرحلة ما بعد الدكتوراه، بيترا، بتوضيح التجربة حيث ستعمل على تحضير عينات الخلايا، بينما سيقوم المهندس، مايكل واغنر، بتشغيل التجربة. لتحضير الخلايا المخصصة لمجهر الفلورسنس ذي الزاوية المتغيرة والانعكاس الداخلي الكلي، يتم استزراع خلايا فردية بكثافة 100 cells per square millimeter على شريحة زجاجية في وسط زراعي مدعم بـ 10% fetal calf serum ومضادات حيوية. تُنمى الخلايا لمدة 72 hours في حاضنة عند 37 °C و 5% carbon dioxide.

بعد ذلك، يتم تطبيق الغشاء الفلوري على الخلايا، وهو marker six D، decano two، dimethyl amino naphthalene، أو lorane بتركيز 8 µM في وسط الزرع، ثم تُحضن الخلايا لمدة 60 دقيقة قبل الفحص بالمجهر الفلوري. تُغسل الخلايا باستخدام PBS، حيث يتم سحب محلول المنظم بواسطة الماصة فوق الشريحة الجسمية لإزالة الوسط، وبعد ذلك، يتم مسح محلول المنظم من الجهة الخلفية للشريحة الجسمية. يُستخدم مجهر رأسي مثل Zeiss Axio plan، مجهز بإضاءة خلفية وكاميرا exon E-M-C-C-D من أجل الزاوية المتغيرة.

يتم استبدال المكثف في مجهر TIRFM بجهاز إضاءة مُصنع خصيصاً يحتوي على منشور زجاجي نصف أسطواني مقترن بصرياً بشريحة العينة. يسقط شعاع الليزر من ليف بصري أحادي النمط ومجمّع، والذي يؤدي بعد تصويره بواسطة المنشور الزجاجي ومكونات بصرية أخرى إلى تكوين شعاع متوازٍ مرة أخرى على سطح العينة. يجب التأكد من أن متجه المجال الكهربائي مستقطب بشكل عمودي على مستوى السقوط.

يتم تحديد هذا الموضع على قارنة المخرجات (output coupler) الخاصة بالألياف. استخدم مرآة قابلة للتعديل تقع داخل المكثف، حيث يتم تصويرها في مستوى العينة وتعمل على إضاءة العينة تحت زاوية سقوط متغيرة أو شعاع جسم. ويمكن تشغيل المرآة القابلة للتعديل بواسطة محرك خطوي (step motor) يتم التحكم فيه عبر برنامج حاسوبي.

يتوافق كل موضع مع زاوية سقوط محددة بدقة وفقاً لما تم تحديده من خلال قياسات المترية الهندسية. ولمعايرة الموضع الزاوي للمرآة القابلة للتعديل، استخدم صبغة فلورية مثل الفلافين نوكليوتيد بتركيز 1 millimolar، مذابة في الماء. ولتحديد الزاوية الحرجة عند تغيير زاوية السقوط، استخدم الزاوية الحرجة البالغة 61.3 درجة لانتقال الزجاج-الماء كقيمة ثابتة، حيث يتم تخزين الموضع الزاوي للمرآة الذي تتساوى عنده زاوية السقوط مع الزاوية الحرجة في برنامج تحديد موضع المرآة.

باستخدام برنامج الكاميرا، قم بضبط معاملات كاميرا E-M-C-C-D، بما في ذلك كسب درجة الحرارة، ووقت التسجيل، وسرعة الإزاحة. استخدم زيت الغمر لضمان التلامس البصري للعينة. وباستخدام منشور زجاجي، اختر عدسة شيئية بتكبير مناسب للخلايا وفتحة عددية متوسطة.

لتصوير الجسم في المجهر، استخدم مرشح تمرير طويل أو مرشح تمرير نطاق مناسب للكشف عن الفلورة. سجل صور الفلورة لعينات متطابقة عند تغيير زاوية الإضاءة. يجب أن تكون زوايا السقوط مساوية للزاوية الحرجة أو أكبر منها.

بما أن الزاوية الحرجة المقابلة لـ 64.5 درجة عند السطح الفاصل بين الخلية والزجاج، يُوصى بنطاق زاوي من 66 درجة إلى 74 درجة وبخطوات قدرها 0.5 درجة أو درجة واحدة. لبدء تحليل البيانات، استخدم برنامج lab view لقراءة الصور المسجلة عند زوايا مختلفة بالإضافة إلى إعدادات الكاميرا، وطول موجة الإثارة، ومعاملات الانكسار. يتم استيراد الإعدادات للزجاج، وهو 1.52، وللخلايا، وهو 1.37، لإجراء تقييم صحيح للبيانات.

لكل مجموعة من المعلمات، يتم حساب عمق الاختراق وعامل النفاذية تلقائيًا. ولضمان نجاح الإجراء، من المهم تسجيل الصور بعناية واختيارها للتحليل. اختر الصور المستخدمة لتقييم المسافات بين الخلايا والركيزة وفقًا للمعادلة.

بالنسبة لعلامة الغشاء، يمكن استبعاد الصور الفردية التي تتميز بإضاءة متجانسة، كما هو موضح في هذا المثال. قم بحساب صور تضاريس ركيزة الخلية واختر رمزاً لونياً مناسباً للعرض أثناء التقييم. يمكن عرض مقاطع البكسلات الفردية كما هو مصور في هذا الشكل.

يمكن استخدام هذه المخططات كمؤشر على جودة الملاءمة. وأخيراً، قم بحفظ بروتوكول التقييم. يوضح هذا الشكل صور الانعكاس الداخلي الكلي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U2 51 mg مع تنشيط جين TP 53 الكابت للأورام.

عند التحضين مع luan والتسجيل بزوايا سقوط مختلفة، حيث تقابل الزاوية 66 درجة عمق اختراق للمجال الكهرومغناطيسي المتلاشي يبلغ حوالي 140 nanometers، والزاوية 69 درجة عمق اختراق يبلغ 75 nanometers، والزاوية 73 درجة عمق اختراق يبلغ 60 nanometers مع تناقص عمق الاختراق. تقل شدة الفلورة وتنشأ من مواقع أكثر سطحية في الخلايا، مثل نقاط الاتصال البؤرية على حوافها. وتظهر المسافات بين الخلية والركيزة في اللوحة D من خلال رمز لوني يتراوح من صفر إلى 600 nanometers كما هو موضح هنا.

تتفاوت المسافات بين الخلايا والركيزة بشكل كبير عبر الخلايا، حيث تتراوح ما بين بضعة نانومترات فقط (يمثلها اللون الأبيض إلى الأصفر) و 250 إلى 300 نانومتر (يمثلها اللون الأحمر الداكن). ويشير هذا إلى أن نقاط التماس البؤرية والمسافات الأكبر بين الخلايا والركيزة تقع في جوار وثيق. وقد حُسب تباين مماثل في المسافات بين الخلايا والركيزة لخلايا الورم الأرومي الدبقي U2 51 mg مع تنشيط الجين الكابح للأورام P 10.

وفي المقابل، كانت المسافات بين الخلايا والركيزة ثابتة نسبياً بالنسبة لخلايا التحكم U2 51 mg الممثلة باللون الأصفر والخلايا البرية الممثلة باللون البرتقالي إلى الأحمر بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تضاريس الركيزة الخلوية لاستكشاف الخلايا الورمية والتغيرات المورفولوجية الناتجة عن العلاج بالليزر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تصوير الأسطح بدقة فعلية في نطاق النانومتر مع تعرض منخفض للضوء، وهو أمر يمكن للكائنات الحية تحمله بشكل جيد.