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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Institut für Angewandte Forschung

&#x7531;&#x4E8E;&#x500F;&#x7535;&#x78C1;&#x573A;&#x7684;&#x4F4E;&#x6E17;&#x900F;&#x6DF1;&#x5EA6;&#x3001; &#x5168;&#x5185;&#x53CD;&#x5C04;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C; (TIRFM) &#x88AB;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x4E00;&#x9879;&#x5F3A;&#x5927;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x5BA1;&#x67E5;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x6216;&#x9644;&#x8FD1;&#x7684;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x5149;&#x654F;&#x5242;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x5174;&#x594B;&#x7684;&#x6FC0;&#x5149;&#x5149;&#x7684;&#x5165;&#x5C04;&#x89D2;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#xFF0C;&#x6E17;&#x900F;&#x6DF1;&#x5EA6;&#x88AB;&#x591A;&#x79CD;&#x591A;&#x6837;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x8D28;&#x62D3;&#x6251;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5BA1;&#x67E5;&#x4E0E;&#x7EB3;&#x7C73;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x7279;&#x6B8A;&#x7167;&#x660E; TIRFM &#x548C;&#x76F8;&#x4E58; (EM) CCD &#x76F8;&#x673A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x7535;&#x5B50;&#x8BBE;&#x5907;&#xFF0C;&#x4E5D; &#xFF08;PPIX&#xFF09; &#x5149;&#x654F;&#x5242;&#x539F;&#x535F;&#x5549;&#x8367;&#x5149;&#x7559;&#x5B66;&#x540E;&#x7684; 5-&#x6C28;&#x57FA;&#x4E59;&#x9170;&#x4E19;&#x9178; &#xFF08;5-ALA) &#x4E4B;&#x524D;&#xFF0C;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x548C;&#x5149;&#x4E9A;&#x81F4;&#x6B7B;&#x5242;&#x91CF;&#x7167;&#x5C04;&#x540E;&#x764C;&#x7EC6;&#x80DE; (635 nm&#xFF0C;4 J/cm2&#xFF09;&#x3002;&#x73BB;&#x7247;&#x76D6;&#x4E0A;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x8D28;&#x7684;&#x8DDD;&#x79BB;&#x5DEE;&#x5F02;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x5E73;&#x5747;&#x8DDD;&#x79BB;&#x5927;&#x7EA6;&#x662F; 120 &#x7684;&#x5927;&#x7EA6; 20 &#x548C; 250 &#x725B;&#x7C73; nm&#x3002;&#x5149;&#x7167;&#x5C04;&#x3001; &#x666E;&#x904D;&#x4E0B;&#x964D;&#x65F6;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8DDD;&#x79BB;&#x548C;&#x5747;&#x503C;&#x4F4E;&#x4E8E; 100 nm &#x5B9E;&#x73B0;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5C40;&#x7076;&#x6027;&#x8054;&#x7CFB;&#x4EBA;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x5904;&#x7406;&#x9EC4;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x7C98;&#x7740;&#x6591;&#x6FC0;&#x9176;&#x5B58;&#x6709;&#x5149;&#x7167;&#x5C04;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x5373;&#x4ECE;&#x5176;&#x57FA;&#x8D28;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x5149;&#x81F4;&#x8131;&#x79BB;&#x662F;&#x4E0D;&#x53EF;&#x80FD;&#x53D1;&#x751F;&#x3002;

ALA &#x5149;&#x52A8;&#x529B;&#x7597;&#x6CD5;&#x4F7F;&#x7528;&#x53EF;&#x53D8;&#x89D2;&#x5168;&#x5185;&#x53CD;&#x5C04;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C; (VA TIRFM) &#x540E;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x886C;&#x5E95;&#x62D3;&#x6251;&#x3002;

Because of the low penetration depth of an evanescent electromagnetic field, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) proved to be a powerful technique to examine fluorescent dyes or photosensitizers in close vicinity to the plasma membrane of living cells. In addition, on variation of the angle of incidence of exciting laser light, the penetration depth is varied, so that cell-substrate topology can be examined with nanometer resolution. Using a specific illumination device for TIRFM and a highly sensitive electron multiplying (EM) CCD camera, fluorescence of the photosensitizer protoporphyrin IX (PPIX) was studied in human cancer cells after application of 5-aminolevulinic acid (5-ALA) prior to and after irradiation with sublethal light doses (635 nm, 4 J/cm2). For cells growing on microscope cover slides, cell-substrate distances varied between approximately 20 and 250 nm with a mean distance of approximately 120 nm. On light exposure, these distances generally decreased, and a mean value below 100 nm was attained. Moreover, focal contacts visualized with a fusion protein of yellow fluorescent protein and focal adhesion kinase were maintained on light exposure, i.e., light-induced detachment of cells from their substrate was not likely to occur.

Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).

En raison de la profondeur de p&eacute;n&eacute;tration faible d&#39;un champ &eacute;lectromagn&eacute;tique &eacute;vanescent, microscopie de fluorescence de r&eacute;flexion totale interne (TIRFM) s&#39;est av&eacute;r&eacute;e une technique puissante pour examiner les colorants fluorescents ou photosensibilisateurs &agrave; proximit&eacute; de la membrane plasmique des cellules vivantes. En outre, sur la variation de l&#39;angle d&#39;incidence de la lumi&egrave;re laser excitante, la profondeur de p&eacute;n&eacute;tration est modifi&eacute;e, afin que la topologie de la cellule-substrat peut &ecirc;tre examin&eacute; avec une r&eacute;solution nanom&eacute;trique. &Agrave; l&#39;aide d&#39;un dispositif d&#39;&eacute;clairage sp&eacute;cifique pour TIRFM et un &eacute;lectron hautement sensible, multipliant la cam&eacute;ra CCD (EM), la fluorescence de la protoporphyrine photosensibilisateur IX (PPIX) a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute;e chez des cellules canc&eacute;reuses humaines apr&egrave;s application d&#39;acide 5-aminol&eacute;vulinique (5-ALA) avant et apr&egrave;s irradiation avec des doses subl&eacute;tales de lumi&egrave;re (635 nm, 4 J/cm2). Pour les cellules qui croissent sur les lames de la couverture, distances de cellule-substrat varient entre environ 20 et 250 nm avec une distance moyenne d&#39;environ 120 nm. Exposition &agrave; la lumi&egrave;re, ces distances g&eacute;n&eacute;ralement diminu&eacute;s et une valeur moyenne inf&eacute;rieure &agrave; 100 nm a &eacute;t&eacute; atteint. En outre, des contacts focaux visualis&eacute;s avec une prot&eacute;ine de fusion de la prot&eacute;ine fluorescente jaune et kinase d&#39;adh&eacute;rence focale ont &eacute;t&eacute; maintenus sur l&#39;exposition &agrave; la lumi&egrave;re, c&#39;est-&agrave;-dire induit par la lumi&egrave;re le d&eacute;tachement des cellules de leur substrat n&#39;&eacute;tait pas susceptible de se produire.

Topologie de la cellule-substrat &agrave; ALA-PDT &agrave; l&#39;aide de la microscopie de fluorescence variable-angle de r&eacute;flexion totale interne (VA-TIRFM).

Durch die geringe Eindringtiefe von fl&uuml;chtig elektromagnetisches Feld erwiesen Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ein leistungsf&auml;higes Verfahren zur Untersuchung von Leuchtstofff&auml;rbungen oder Photosensitizer in unmittelbarer N&auml;he der Plasmamembran lebender Zellen. Dar&uuml;ber hinaus ist auf Variation von der Einfallswinkel von spannenden Laserlicht, die Eindringtiefe variiert damit Zell-Substrat Topologie mit Nanometer-Aufl&ouml;sung untersucht werden kann. Mit einer besonderen Beleuchtungseinrichtung f&uuml;r TIRFM und ein hochsensibler Elektron multiplizieren (EM) CCD-Kamera, Fluoreszenz von der Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PPIX) wurde untersucht in menschlichen Krebszellen nach Anwendung von 5-Aminolevulinic S&auml;ure (5-ALA) vor und nach der Bestrahlung mit subletalen Dosen der leichten (635 nm, 4 J/cm2). F&uuml;r Zellen wachsen auf Objekttr&auml;ger Abdeckung, Zell-Substrat Entfernungen variiert zwischen etwa 20 und 250 nm mit einer mittleren Entfernung von etwa 120 nm. Auf Belichtung, diese Abst&auml;nde im Allgemeinen abgenommen und einen Wert unter 100 nm erreicht wurde. Dar&uuml;ber hinaus fokale Kontakte mit ein Fusionsprotein gelb fluoreszierenden Proteins visualisiert und fokale Adh&auml;sion Kinase wurden gepflegt auf Belichtung, d. h. Licht induziert Losl&ouml;sung von Zellen aus ihrem Substrat nicht wahrscheinlich war.

Zell-Substrat Topologie auf ALA-PDT mit Variable Winkel Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM).

A causa della profondit&agrave; di penetrazione bassa di un campo elettromagnetico evanescente, microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) ha dimostrato di essere una tecnica potente per esaminare le tinture fluorescenti o fotosensibilizzanti nelle immediate vicinanze della membrana plasmatica delle cellule viventi. Inoltre, sulla variazione dell&#39;angolo di incidenza della luce laser emozionante, la profondit&agrave; di penetrazione &egrave; varia, cos&igrave; che la topologia di cellula-substrato pu&ograve; essere esaminato con risoluzione nanometrica. Utilizzando un dispositivo di illuminazione specifici per TIRFM e un elettrone altamente sensibile moltiplicando telecamera CCD (EM), fluorescenza della protoporfirina IX (PPIX) fotosensibilizzatore &egrave; stata studiata in cellule tumorali umane dopo applicazione di acido 5-aminolevulinico (5-ALA) e dopo irradiazione con dosi subletali di luce (635 nm, 4 J/cm2). Per le cellule crescono su vetrini da microscopio copertura, distanze di cellula-substrato varia tra circa 20 e 250 nm con una distanza media di circa 120 nm. Esposizione alla luce, queste distanze generalmente diminuite, e un valore medio inferiore a 100 nm &egrave; stato raggiunto. Inoltre, focale contatti visualizzati con una proteina di fusione della proteina fluorescente gialla e chinasi focale di adesione sono stati effettuati sull&#39;esposizione alla luce, cio&egrave; distacco luce-indotta delle cellule dal loro substrato non era probabile che si verifichi.

Topologia di cellula-substrato su ALA-PDT usando microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale ad angolo variabile (VA-TIRFM).

&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4F4E;&#x3044;&#x6D78;&#x900F;&#x6DF1;&#x3055;&#x30A8;&#x30D0;&#x30CD;&#x30BB;&#x30F3;&#x30C8;&#x96FB;&#x78C1;&#x754C;&#x306E;&#x5185;&#x90E8;&#x5168;&#x53CD;&#x5C04;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1; (TIRFM) &#x86CD;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x751F;&#x304D;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x539F;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x8FD1;&#x304F;&#x5149;&#x5897;&#x611F;&#x5264;&#x3092;&#x691C;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5206;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30BB;&#x30EB;&#x57FA;&#x677F;&#x30C8;&#x30DD;&#x30ED;&#x30B8; &#x30CA;&#x30CE;&#x30E1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x30A8;&#x30AD;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306A;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x5149;&#x306E;&#x5165;&#x5C04;&#x89D2;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x3001;&#x6D78;&#x900F;&#x6DF1;&#x3055;&#x3001;&#x69D8;&#x3005; &#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x7167;&#x660E;&#x88C5;&#x7F6E;&#x89B3;&#x5BDF;&#x304A;&#x3088;&#x3073; (EM) &#x306E; CCD &#x30AB;&#x30E1;&#x30E9;&#x3092;&#x4E57;&#x3058;&#x3066;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x96FB;&#x5B50;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x5149;&#x5897;&#x611F;&#x5264;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30DD;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A3;&#x30EA;&#x30F3; IX (PPIX) &#x306E;&#x3072;&#x3068;&#x764C;&#x7D30;&#x80DE;&#x81F4;&#x6B7B;&#x91CF;&#x5149;&#x7167;&#x5C04;&#x5F8C;&#x3068; 5-&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x30EC;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178; (ALA) &#x3059;&#x308B;&#x524D;&#x306B;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F; &#xFF08;635 nm 4 J/cm 2&#xFF09;&#x3002;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306E;&#x30AB;&#x30D0;&#x30FC; &#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C9;&#x306B;&#x6210;&#x9577;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x57FA;&#x677F;&#x8DDD;&#x96E2;&#x5909;&#x5316;&#x7D04; 120 &#x306E;&#x5E73;&#x5747;&#x8DDD;&#x96E2;&#x3068;&#x7D04; 20 &#xFF5E; 250 nm &#x306E;&#x9593; nm&#x3002;&#x5149;&#x306E;&#x9732;&#x51FA;&#x3001;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;, &#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8DDD;&#x96E2;&#x3001;&#x5E73;&#x5747;&#x5024;&#x4EE5;&#x4E0B; 100 nm &#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x7126;&#x70B9;&#x306E;&#x9023;&#x7D61;&#x5148;&#x9EC4;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x7126;&#x70B9;&#x63A5;&#x7740;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x305F;&#x3078;&#x306E;&#x5149;&#x7167;&#x5C04;&#x3001;&#x3059;&#x306A;&#x308F;&#x3061;&#x3001;&#x57FA;&#x677F;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5149;&#x8A98;&#x8D77;&#x5265;&#x96E2;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x30BB;&#x30EB;&#x57FA;&#x677F;&#x30C8;&#x30DD;&#x30ED;&#x30B8; &#x30A2;&#x30E9;-PDT &#x89D2;&#x53EF;&#x5909;&#x5168;&#x5185;&#x90E8;&#x53CD;&#x5C04;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1; (VA-TIRFM) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x306F;&#x3002;

&#xC0AC;&#xB77C;&#xC838;&#xAC00; &#xC804;&#xC790;&#xAE30;&#xC7A5;&#xC758; &#xB0AE;&#xC740; &#xCE68;&#xD22C; &#xAE4A;&#xC774; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xCD1D; &#xB0B4;&#xBD80; &#xBC18;&#xC0AC; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; (TIRFM) &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC; &#xB610;&#xB294; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC00;&#xAE4C;&#xC6B4; &#xC8FC;&#xBCC0;&#xC5D0; photosensitizers&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xAE30;&#xC220; &#xC785;&#xC99D;. &#xB610;&#xD55C;, &#xD765;&#xBBF8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xBE5B;&#xC758; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xB960;&#xC758; &#xAC01;&#xB3C4;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xCE68;&#xD22C; &#xAE4A;&#xC774; &#xB2E4;&#xC591;, &#xB098;&#xB178;&#xBBF8;&#xD130; &#xBD84;&#xD574;&#xB2A5; &#xD734;&#xB300;&#xD3F0; &#xAE30;&#xD310; &#xD1A0;&#xD3F4;&#xB85C;&#xC9C0;&#xB97C; &#xAC80;&#xC0AC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. TIRFM&#xACFC; &#xC99D;&#xC2DD; (EM) CCD &#xCE74;&#xBA54;&#xB77C;&#xB294; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xC870;&#xBA85; &#xC7A5;&#xCE58;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, photosensitizer protoporphyrin IX (PPIX)&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xC778;&#xAC04; &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; 5-aminolevulinic &#xC0B0; (5-ALA) &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC801;&#xC6A9; &#xD55C; &#xD6C4; &#xACE0; sublethal &#xBE5B; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xACFC; &#xBC29;&#xC0AC;&#xC120; &#xC870;&#xC0AC; &#xD6C4;&#xC5D0; &#xACF5;&#xBD80;&#xB294; (635 nm, 4 J/cm2). &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xCEE4;&#xBC84; &#xC2AC;&#xB77C;&#xC774;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xC131;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xC140;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD734;&#xB300;&#xD3F0; &#xAE30;&#xD310; &#xAC70;&#xB9AC; &#xC57D; 120&#xC758; &#xD3C9;&#xADE0; &#xAC70;&#xB9AC;&#xC640; &#xC57D; 20, 250 nm &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB274; &#xBA55;&#xC2DC;&#xCF54;. &#xBE5B;&#xC758; &#xB178;&#xCD9C;, &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC10;&#xC18C;,&#xC774; &#xAC70;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xD3C9;&#xADE0; &#xAC12; 100 nm&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xCD08;&#xC810; &#xC5F0;&#xB77D;&#xCC98; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654; &#xB178;&#xB780;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC735;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xCD08;&#xC810; &#xC811;&#xCC29; &#xB2C8; &#xC720;&#xC9C0; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xBE5B;&#xC758; &#xB178;&#xCD9C;&#xC5D0; &#xC989;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC140;&#xC758; &#xBE5B;&#xC744; &#xC774;&#xC6A9;&#xD55C; &#xBD84;&#xB9AC;&#xB294; &#xBC1C;&#xC0DD;.

ALA-PDT &#xAC00;&#xBCC0; &#xAC01;&#xB3C4; &#xCD1D; &#xB0B4;&#xBD80; &#xBC18;&#xC0AC; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; (TIRFM VA)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB530;&#xB77C; &#xD734;&#xB300;&#xD3F0; &#xAE30;&#xD310; &#xD1A0;&#xD3F4;&#xB85C;&#xC9C0;.

Debido a la profundidad de penetraci&oacute;n bajo de un campo electromagn&eacute;tico evanescente, microscop&iacute;a de fluorescencia de reflexi&oacute;n interna total (TIRFM) result&oacute; para ser una t&eacute;cnica poderosa para examinar tintes fluorescentes o photosensitizers cercana a la membrana plasm&aacute;tica de las c&eacute;lulas vivas. Adem&aacute;s, en la variaci&oacute;n del &aacute;ngulo de la incidencia de luz de l&aacute;ser emocionante, la profundidad de penetraci&oacute;n es variada, de modo que topolog&iacute;a celular-substrato puede ser examinado con resoluci&oacute;n del nan&oacute;metro. Utilizando un dispositivo de iluminaci&oacute;n espec&iacute;ficos para TIRFM y un electr&oacute;n altamente sensible multiplicando c&aacute;mara CCD (EM), fluorescencia de la protoporfirina IX (PPIX) del fotosensibilizador fue estudiada en c&eacute;lulas cancerosas humanas despu&eacute;s de la aplicaci&oacute;n de &aacute;cido 5-aminolevul&iacute;nico (5-ALA) antes y despu&eacute;s de la irradiaci&oacute;n con dosis subletales de luz (635 nm, 4 J/cm2). Las c&eacute;lulas crecen en portaobjetos cubierta, distancias de c&eacute;lula-sustrato variaron entre unos 20 y 250 nm con una distancia media de aproximadamente 120 nm. En la exposici&oacute;n a la luz, estas distancias generalmente disminuidas y un valor medio por debajo de 100 nm se logr&oacute;. Por otra parte, contactos focales visualizaron con una prote&iacute;na de fusi&oacute;n de la prote&iacute;na fluorescente amarilla y quinasa de adhesi&oacute;n focal se mantuvieron en la exposici&oacute;n a la luz, es decir, inducida por la luz de la separaci&oacute;n de c&eacute;lulas a partir de su sustrato no era probable que ocurra.

Topolog&iacute;a de la c&eacute;lula-sustrato al ALA-PDT utilizando microscop&iacute;a de fluorescencia de reflexi&oacute;n interna total de &aacute;ngulo variable (VA-TIRFM).

Harald Baumann

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