على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن
June 27th, 2012
يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا المريض.
الهدف العام من التجربة التالية هو فحص التعبير الجيني باستخدام الآلات النووية الوظيفية المستخرجة من الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصاد الأول في تورم خلايا هيلا. بعد ذلك ، يتم ربط الخلايا عن طريق الهبوط ثم أجهزة الطرد المركزي لحبيبات النوى في الخطوة الثالثة.
يتم استخراج النوى من الملح وتركيزها وتحويلها من أجل الحصول على آلات التعبير الجيني القابلة للذوبان والوظيفية. في النهاية ، يمكن تقييم وظائف المستخلصات النووية بناء على أنشطة النسخ والتضفير الخاصة بها كما تم تقييمها باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي المقترن بنظام النسخ والتضفير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تحضير مستخلص النواة السائبة ، هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يمكن استخدام كمية صغيرة من الخلايا لتحضير مستخلص النوى.
ابدأ بطلاء خلايا هيلا على ثلاث ألواح مقاس 150 ملم مع وسائط DMEM مكملة ب FBS والمضادات الحيوية ، وقم بزراعة الثقافات في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل الخلايا إلى 90٪ من الطلاقة في هذه المرحلة ، استنشق الوسائط من مزارع خلايا HELOC واغسلها مرة واحدة ب 13 مل من درجة حرارة الغرفة. PBS لكل لوحة ثم الشفط. يقف PBS كل لوحة على جانبها لبضع ثوان ويستنشق بقية PBS.
بعد ذلك ، استخدم رافع الخلايا لكشط الخلايا إلى الحافة السفلية لكل لوحة ، ثم اسحب الخلايا في أنبوب einor سعة 1.5 ملليلتر. أخيرا ، قم بتحبيير الخلايا في فوج صغير لمدة خمس دقائق بمائة مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية. الآن قم بشفط PBS من حبيبات الخلية وتقدير حجم الخلية المعبأة أو PCV من خلال النظر إلى التدرج على الأنبوب.
ثم أضف ضعف حجم المخزن المؤقت منخفض التوتر مثل PCV إلى حبيبات الخلية. رج الأنبوب برفق لتعليقه. تقوم الخلايا بسحب تعليق الخلية برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر لإخراج مجموعات الخلايا حسب الضرورة.
ثم قم بتكسير الخلايا في ظل نفس ظروف الطرد المركزي كما كان من قبل. بعد الطرد المركزي ، قم بسحب الطبقة العازلة منخفضة التوتر بعناية. ستبدأ الخلايا في الانتفاخ وسيزداد حجم الخلية إلى حوالي 750 إلى 1000 ميكرولتر.
أضف عازلة منخفضة التوتر جديدة إلى الحجم النهائي البالغ 1.5 مل وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت. مرة أخرى. أخيرا ، احتضان الخلايا المتورمة المعلقة على الجليد لمدة 10 دقائق أثناء برودة الخلايا. اشطف الخالط السفلي بمحلول منخفض التوتر ثم ضعه على الجليد مع الخلايا.
ثم باستخدام ممسحة مهمة دقيقة مثل منديل كيم ، جفف المدقة. استخدم طرف ماصة صغيرة ممتدة سعة 1000 ميكرولتر لإزالة المخزن المؤقت من الهبوط. استخدم الآن الماصة لنقل الخلايا المتورمة المبردة إلى أسفل الهبوط.
هو أصعب جزء من هذا الإجراء لإدخال نجاح تحقق من التحلل. بعد كل هبوط في المجهر ، حرك ببطء المدقة الضيقة للهبوط لأعلى ولأسفل خمس مرات لقمل الخلايا مع الحرص على تجنب الفقاعات. بعد ذلك ، قم بنقل خمسة ميكرولتر من Eloqua من تعليق خلية lys إلى أنبوب einor وأضف 10 ميكرولتر من Trian Blue و 15 ميكرولترا من XPBS واحد.
أضف محلول الخلية إلى شريحة وافحص الخلايا تحت المجهر الضوئي للتحلل ، ستظهر نوى خلايا ليس باللون الأزرق بعد ثلاث أونصات. لا يوجد تحلل كاف حيث تظهر العديد من الخلايا الحية. بعد خمس أونصات ، هناك ما يكفي من التحلل.
أخيرا ، انقل خلايا ليز إلى أنبوب einor المبرد مسبقا وقم بتدوير معلق الخلية لمدة خمس دقائق في fuge دقيق عند 1500 مرة G وأربع درجات مئوية. ثم انقل سوبر ناتين بعناية إلى أنبوب جديد دون تعطيل الحبيبات. الآن ، قم بتقدير الحجم النووي للرقعة أو PNV من خلال النظر إلى التدرج على الأنبوب.
املأ طرف الماصة الدقيقة بمحلول ملحي منخفض عند نصف PNV. ثم أدخل طرف الماصة الدقيقة في النوى الموجودة أسفل أنبوب einor. رش المخزن المؤقت ببطء في النوى أثناء الخلط برفق.
قمبنقر الأنبوب برفق للتأكد من تعليق الحبيبات تماما. بعد ذلك ، أضف عازلة عالية من الملح عند نصف PNV واخلطها بسرعة مرة واحدة عن طريق قلب الأنبوب. قم بتدوير الأنبوب لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
أخيرا ، قم بتدوير النوى في الفوج الدقيق لمدة 15 دقيقة عند 18،000 مرة جم وأربع درجات مئوية. ابدأ بنقل 500 ميكرولتر من المادة الطافية إلى سلبيات دقيقة مبردة. قم بتدوير المستخلص النووي عالي الملح لمدة 15 دقيقة عند 14،000 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية بعد الطرد المركزي ، وقم بقلب الراكون الصغير وضعه في أنبوب الاستخلاص المعزز للنفط الفردي الجديد.
بعد الدوران لمدة دقيقتين عند 1000 مرة جم وأربع درجات مئوية ، سيتم تركيز المستخلص النووي عالي الملح إلى حوالي 115 ميكرولترا. الآن انقل 45 ميكرولتر من المستخلص النووي عالي الملح إلى SLIs لغسيل الكلى المصغر. تأكد من أن الجزء السفلي من الشريحة مع الجزء السفلي من العوامة.
ثم ضع SLIs في 500 مل من محلول غسيل الكلى المبرد. أخيرا ، حرك الكميات لمدة ساعة إلى ساعتين عند أربع درجات مئوية ، سيظهر المستخلص النووي غائما بعد غسيل الكلى. يوضح هذا الشكل بيانات تمثيلية تقارن تفاعل نسخ وتقطيع بوليميراز الحمض النووي الريبي المقترن في مستخلص نووي صغير الحجم مقابل مستخلص نووي سائب.
عندما تم احتضان بنية A-C-M-V-D-N-A في مقتطفات كبيرة أو صغيرة الحجم ، تم تصنيع مستويات مماثلة من mRNA المسبق الناشئ بواسطة النقطة الزمنية لمدة خمس دقائق بعد إضافة alpha و manin لمنع المزيد من النسخ ، تراكمت المواد الوسيطة للربط ومنتجات لصق بمرور الوقت مع حركية مماثلة في كلا النوعين من المستخلصات. تؤكد هذه النتائج التمثيلية أن كفاءات نظام النسخ والتضفير ثنائي بوليميراز الحمض النووي الريبي المقترن متشابهة في المستخلصات النووية السائبة والصغيرة. لإثبات فائدة المستخلص على نطاق صغير ، تم تحضير مستخلصات الطريقة من خلايا هيلا المعالجة بمثبط التضفير E 7 1 0 7 أو مركب التحكم السلبي Platy analy F ثم تم إجراء مقايسة نسخ وتضفير RNA مقترنة كما هو موضح في هذا الشكل ، حدث نسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني بكفاءة في المستخلصات المحضرة من كل من منقوشة F و E 7 1 0 7 المعالجة خلايا.
في المقابل ، حدث التضفير بشكل طبيعي في المستخلص المحضر من الخلايا المعالجة بتحليل F ، ولكن تم إلغاؤه في الخلايا المعالجة E 7 1 0 7. توفر هذه البيانات دليلا على مفهوم استخدام المستخلصات النووية الصغيرة الحجم للمعالجة الخاصة للخلايا على نطاق صغير. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أقل من خمس ساعات.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة بروتوكولًا لتحضير مستخلصات نووية صغيرة الحجم من خلايا HeLa، وهو قيم للتحليلات التي تتطلب أعدادًا صغيرة من الخلايا. يمكن تطبيق الطريقة على تحليلات متنوعة للتعبير الجيني وأنواع أخرى من الخلايا، بما في ذلك خلايا المرضى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- التعبير الجيني
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- تُستخدم خلايا HeLa على نطاق واسع في البحوث لدراسة العمليات الخلوية.
- المستخلصات النووية ضرورية لفهم آليات التعبير الجيني.
- غالبًا ما تتطلب الطرق التقليدية أعدادًا كبيرة من الخلايا، مما يحد من تطبيقها.
- يسمح هذا البروتوكول باستخدام كميات صغيرة من الخلايا، مما يزيد من تنوعها.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لتحضير مستخلصات نووية صغيرة الحجم من خلايا HeLa.
- لتمكين تحليلات التعبير الجيني بأرقام محدودة من الخلايا.
- لتقييم فعالية المستخلصات النووية في أنشطة النسخ والربط.
الطرق المستخدمة
- حصاد الخلايا وتضخمها.
- الطرد المركزي لتشكيل نوى الخلايا واستخراج الملح.
- الغسيل الكلوي للمستخلصات النووية للحصول على المكونات القابلة للذوبان.
- تقييم أنشطة النسخ والربط باستخدام نظام بوليميراز الحمض النووي الريبي المقترن.
النتائج الرئيسية
- تظهر المستخلصات النووية صغيرة الحجم كفاءة مماثلة في النسخ والربط مقارنة بالمستخلصات الضخمة.
- تؤكد التحليلات الوظيفية على فائدة الطريقة على نطاق صغير.
- تظهر النتائج قابلية تطبيق الطريقة على الخلايا المعالجة بالمثبطات.
- تدعم البيانات فعالية البروتوكول في دراسات التعبير الجيني المختلفة.
الاستنتاجات
- تحضير المستخلص النووي صغير الحجم فعال ومتنوع.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على تحليلات مختلفة تتطلب أعدادًا محدودة من الخلايا.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذا البروتوكول في التحقيقات البيولوجية المتنوعة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Small-scale nuclear extract preparation enables functional gene expression assays from limited cell populations, supporting rapid evaluation of cellular responses to diverse treatments. This capability is critical for biopharma teams working with scarce patient samples, engineered cell lines, or drug-exposed populations where bulk extraction is impractical. The method enhances predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking by allowing direct assessment of transcription and splicing machinery under relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression pathways in cells exposed to drugs, RNAi, or DNA-damaging agents.
- Supports mechanistic de-risking by directly measuring transcription and splicing activity post-treatment.
- Facilitates functional target validation using minimal cell input, including rare or patient-derived samples.
Screening & Assay Development
- Provides validated nuclear extracts for quantitative transcription and splicing assays.
- Improves assay reproducibility and standardization across small-scale experiments.
- Enables rapid screening of compound effects on gene expression machinery.
Translational & Preclinical Research
- Allows functional assessment of gene expression in disease-relevant or patient-derived cells.
- Supports translational biomarker studies by enabling mechanistic assays with limited clinical material.
- Bridges discovery and preclinical validation by maintaining assay continuity across cell types and treatments.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional gene expression assays from early target validation through translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring transcription and splicing outputs after specific cellular perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready nuclear extracts for reproducible, quantitative evaluation of compound or genetic interventions.
- Analytics: Provides direct readouts of transcription and splicing efficiency, enabling robust comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro discovery to preclinical studies using limited or patient-derived samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for functional nuclear extract preparation across diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes extract preparation for reproducibility and scalability in small-scale settings.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions and efficient resource allocation by supporting functional assays with minimal material.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization by allowing functional validation in rare or limited cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell handling, nuclear extraction, and functional gene expression assays.
- Needs access to centrifugation, dialysis, and quantitative assay infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible extract quality and assay outputs.
- Adaptable to various cell types, but optimization may be needed for non-HeLa systems.
- Limited by the minimum cell number required for detectable transcription and splicing activity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Growing and Harvesting HeLa Cells for Nuclear Extraction
1:56
Swell HeLa Cells in Hypotonic Buffer
3:00
Lyse Cells using a Dounce Homogenizer
4:27
Salt-extract the Nuclei
5:15
Concentrate and Dialyze the Nuclear Extract
6:16
Results: Small-scale Nuclear Extract Technique for Functional Assays of Gene Expression Machineries
7:51
Conclusion
