تحسين التصور الانبثاث الرئة في قرار خلية واحدة في الفئران عن طريق الجمع بين في الوضع الطبيعي الإرواء من أنسجة الرئة وX-غال تلوين لل lacZ الكلمات الدلالية الخلايا السرطانية،

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين الكشف عن النقائل الدقيقة في رئة الفأر خارج الجسم الحي مع الحفاظ على بنية الرئتين المنتفخة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع الرئة أولا في الموقع باستخدام PBS لإزالة الدم ، وهو المصدر الرئيسي للخلفية الملونة في هذا الأنسجة. الخطوات التالية هي تضخيم الرئة عن طريق حقن PFA ، ثم الضغط لإصلاح أنسجة الرئة تحت النفخ.

بعد ذلك ، تتم إزالة الرئة وتثبيتها بشكل أكبر في PFA أو يتم تضمين فصوص الرئة المفردة للاستئصال بالتبريد. تتمثل الخطوات النهائية في تلطيخ الأنسجة في محلول Xal وتصور الخلايا السرطانية LA zag في النهاية يمكن الكشف عن ورم خبيث على فصوص الرئة بأكملها أو في أقسام أنسجة الرئة وصولا إلى مستوى الخلية المفردة باستخدام مجهر مجهر أو مجهر ضوئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل السماء التي تقف من تلقاء نفسها ، هي أن قابلية اكتشاف النقائل الدقيقة قد تحسنت بشكل كبير بسبب إزالة الخلفية المتعلقة بالدم.

ابدأ البروتوكول بتخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من الكيتامين والزيلازين والآس برومازين في حوالي 150 ميكرولتر من PBS. عندما لا يتم ملاحظة ردود أفعال الألم للماوس ، قم بإصلاحه على طاولة العمليات. تراجع إلى أسفل وقم بمسح الشعر بنسبة 70٪ من الإيثانول.

افتح الجلد من البطن إلى الرقبة. اسحب الجلد إلى الجانبين أو قم بإزالته. افتح الصفاق بعناية في الصدر لمنع تمزق الأوعية الكبيرة مثل الوداجي الفيني.

سيؤدي ذلك إلى تحسين كفاءة التروية. الآن قم بقص الوريد الأجوف الكاردي تحت الكبد باستخدام حقنة سعة 20 مليلتر بإبرة قياس 21 إلى 24. حقن ببطء من 10 إلى 15 مل من PBS في البطين الأيمن للقلب النابض حتى تصبح الرئة بيضاء تماما ويتوقف القلب عن النبض.

ثم اضغط على الأوعية الدموية فوق الكبد والحجاب الحاجز بمشبك الأوعية الدموية. قم بتحميل حقنة 10 ملليلتر مع 3٪ ألدهيد بارافورم ، وبحقن إبرة قياس 21 إلى 24 في البطين الأيمن. ما يقرب من ملليلتر.

اكشف القصبة الهوائية خارج الصدر وقم بتضخيم الرئة بحقنة في القصبة الهوائية بحوالي ثلاثة ملليلتر من الألدهيد من خارج الصدر. ثم مباشرة بعد إزالة الإبرة ، قم بقرص القصبة الهوائية المدللة بالثقب باستخدام مشبك الأوعية الدموية وانتظر 10 دقائق للسماح بالتثبيت. بعد ذلك ، قم بتمرير الأوعية الدموية فوق المشبك الوعائي.

ثم قم بإزالة المشبك وحقن ما يقرب من ملليلترين من PBS في البطين الأيمن لإزالة الفورمالديهايد الزائد. ثقب الأجزاء السفلية من جميع فصوص الرئة بإبرة وإزالة المشبك الوعائي في القصبة الهوائية. الآن حقن ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من محلول التضمين المخفف في القصبة الهوائية المدللة بالحقنة الأخرى.

أوقف الحقن عندما يتم استبدال مخبأ الطفيلي في فصوص الرئة بالمحلول. قم بإزالة الرئة بعناية عن طريق سحب القلب بالملقط وعن طريق تمرير أربطة النسيج الضام والأوعية الدموية والقصبة الهوائية. تأكد من إبقاء القلب متصلا بالرئتين.

ضع فصا واحدا جانبا لأقسام التبريد واستخدم أنسجة الرئة المتبقية للتلوين الطويل بالكامل. ضع الرئة في كوب بلاستيكي بغطاء إغلاق محكم وثبته بنسبة 2٪ فورمالديهايد و PBS. ضع قطعة من الشاش فوق الرئة لإبقائها في المحلول واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد نصف ساعة ، قم بإزالة محلول التثبيت وغسل الأنسجة جيدا باستخدام PB S3 مرات ، قم بإعداد محلول xal الجاهز للاستخدام عن طريق تخفيف مليلتر واحد من محلول مخزون Xal ، واحد إلى 40 في محلول التلوين الأساسي وإضافة ما لا يقل عن 10 مل منه في الكوب. اغرق الرئة بقطعة من الشاش. قم بتأمين الغطاء بشكل غير محكم للسماح بتبادل الهواء واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس ساعات محميا من الضوء.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول xal. اشطف الرئتين مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة محلول xal المتبقي وأضف ما لا يقل عن 10 ملليلتر من 4٪ ألدهيد بارافورم في PBS. الأنسجة جاهزة الآن للأنسجة ويمكن تخزينها لفترة طويلة في 4٪ PFA عند أربع درجات مئوية.

ابدأ بملء ثلث قالب التضمين بوسط تضمين بولي فورز غير المخفف. ثم قم بتحميل فص الرئة في القالب واستمر في إضافة الوسط حتى يتم تغطية الفص بالكامل. تجنب بعناية صنع فقاعات الهواء الآن تحتضن الفص المدمج عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد الرئتين المضمنتين للتقسيم عن طريق تجميدها ببطء في خليط من الثلج الجاف و isop pentane. إذا لزم الأمر ، يمكن الآن نقلها إلى فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على ناظم البرد ، وقطع أقسام التبريد من سبعة إلى 10 ميكرون من الفص ، قم بتركيب الأقسام إلى شرائح جاهزة لقسم التبريد المتاح تجاريا بمجرد تركيبها ، احتضان الأقسام على الفور في محلول تلطيخ xal عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في غرفة رطبة. في اليوم التالي ، اشطف الشرائح في PBS مرتين لمدة خمس دقائق لكل شطف.

اتبع ذلك بشطف قصير بالماء المقطر. الآن قم بتصويب الشرائح باللون الأحمر السريع لمدة 10 ثوان للحصول على بقعة مضادة ضعيفة تجعل xal أكثر هيمنة واشطف البقعة المضادة على الفور بالماء المقطر. للحصول على بقعة مضادة أغمق ، قم بتمديد الوقت حتى 30 ثانية أو أكثر.

قم بتركيب الشرائح مع حامل مناعي. تمت إعادة التحقيق في تكوين النقائل في نماذج LM الثمانية لنظام التشغيل الماوس. باستخدام الصور التمثيلية الموصوفة هنا لرئتي الفئران المنقوع وغير المنفوخة ، التي تم حقنها في وقت واحد مع تحلل متساهلة ، محول وغير متحول ، تم التحكم فيه ، وثمانية خلايا LM في الفئران المحقونة بخلايا يتم التحكم فيها.

ظلت النقائل العيانية والمجهرية غير قابلة للاكتشاف في الرئتين غير المنفوخة والمنفخة. ولكن من المثير للاهتمام في الفئران التي تم حقنها بخلايا LA Z ، أن تلطيخ xgl كشف عن بؤر نقيلية زرقاء للخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا الصغيرة على سطح الرئتين غير المنفوخة في الموقع والتروية وتثبيت الرئتين يحسن من إمكانية اكتشاف النقائل الدقيقة dun la z ، ومع ذلك ، لم يلاحظ نمو البؤر العيانية في الفئران التي تم حقنها بثماني خلايا LM شفافة ، تم التعرف على البؤر النقيلية الكبيرة التي بالكاد يمكن اكتشافها والتي يزيد قطرها عن 0.1 ملم في الرئتين غير المنفوختين. لم يحسن نضح الرئة الكشف عن البؤر.

ومع ذلك ، في الفئران التي تم حقنها بخلايا LAC Z ، تم الكشف عن نقائل كبيرة متعددة من بقع X جالون على سطح الأعضاء غير المنفوخة. كما تم الكشف عن النقائل الدقيقة على سطح الأعضاء غير المنفوخة. علاوة على ذلك ، أدى نضح الرئتين إلى تحسين إمكانية اكتشاف النقائل الكبيرة والدقيقة.

وبالتالي ، أصبحت النقائل الدقيقة والكلية مرئية بكثافة أعلى وعدد أكبر ويرجع ذلك أساسا إلى شفافية الأنسجة المنفوخة التي أصبحت فيها البؤر الموجودة أسفل سطح العضو مرئية أيضا. أكد تحليل نسيجي إضافي باستخدام أقسام التبريد من أنسجة الرئة تحسين قابلية الكشف عن نقائل الرئة في الفئران التي تم حقنها باستخدام LAX Z المنقولة والخلايا المحورة وراثيا في الفئران المصابة بأورام أولية مشتقة من خلايا Dun LAX Z. تم التعرف على النقائل الدقيقة أو حتى بؤر الخلية المفردة في أقسام الرئة.

لم يلاحظ هذا في الفئران المصابة بأورام أولية في خلايا التحكم المعنية. علاوة على ذلك ، كانت النقائل الكبيرة مرئية أيضا بشكل أكثر وضوحا في الفئران التي تم حقنها بثماني خلايا LA C LM مقارنة بالحيوانات التي تحتوي على ثماني خلايا LM. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تروية الرئة وتثبيتها في ZI الثاني والتلوين اللاحق للورم الخبيث في الرئتين المستأثورة.

هذه التقنية هي نقطة نهاية حساسة للغاية تمت قراءتها لتوزيع ورم خبيث في الرئة في أي نوع من دراسات السرطان ، ويمكن أن تكون أيضا بمثابة معيار لتحسين تقنيات التصوير الحالية في الجسم الحي مثل التصوير المقطعي المحوسب الصغير والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير بالرنين المغناطيسي المستخدمة للكشف المبكر عن الآفات النقيلية.