شامل التنميط من لائحة الدوبامين في المادة السوداء والمنطقة الجوفية السقيفية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق أقصى قدر من المعلومات المستمدة من القراءات الجزيئية المرتبطة بتنظيم الدوبامين من تشريح نسيجي واحد للمناطق الجسدية الشجيرية في الدماغ المتوسط. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء تشريح دقيق لفصل المادة السوداء عن المنطقة البطنية السجالية. وتتمثل الخطوة الثانية في معالجة الأنسجة لتحليل الدوبامين بواسطة HPLC، ومواصلة معالجة البروتين الداخلي المرسب لإجراء التحليل.

بعد ذلك، تسمح معالجة البروتين المرسب لتقدير محتوى البروتين الكلي بتحديد أي من البروتينات المنظمة للدوبامين أو فسفرة البروتين يمكن قياسها بالتزامن مع قراءة محتوى الدوبامين في أنسجة العينة. وفي نهاية المطاف، تتيح تحليلات الدوبامين والبروتينات المنظمة له في المناطق التشجرية الجسدية المتميزة في الدماغ المتوسط استخلاص استنتاجات بشأن الآليات الجزيئية المرتبطة بتنظيم الدوبامين.

تؤثر المونوامينات على العديد من النواتج السلوكية، وبالفعل يهتم الباحثون في مجالات الإدمان، والبيولوجيا، والخلل الحركي -كما هو الحال بشكل ملحوظ في مرض باركنسون- بكيفية تأثير المونوامينات مثل الدوبامين، والذي ندرسه في مختبري، على النواتج السلوكية. ولكن أهمية دراسة المونوامينات يمكن تعزيزها بشكل أكبر إذا فهمنا كيفية تنظيمها على المستوى الجزيئي. وتكمن فائدة تقنيتنا في أنه يمكننا استخلاص قراءات متعددة من عينة واحدة مأخوذة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وبذلك يمكننا الحصول على قراءة كاملة لمدى تأثير الأحداث الجزيئية على خلل تنظيم المونوامينات.

يمكننا أخذ هذه البيانات ثم وضعها في سياق كيفية تأثر السلوك. وبوجه عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تقدير كمية البروتين والفسفرة يتطلب معرفة مقدار البروتين الكلي الذي سيكون مطلوباً للحصول على قراءة دقيقة بناءً على الأجسام المضادة التي يختارها الباحث. لذا يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية.

تعد تقنيات التشريح وتحديد الوسائل الأحادية باستخدام البروتينات التنظيمية نهجاً حديثاً نسبياً لتحليل التنظيم في الجسم الحي (in vivo). لبدء هذا الإجراء، قم بتبريد مصفوفة دماغ القارض، وطبق بتري يحتوي على خمس شفرات ومشرط رقم 11 على طبقة من الثلج الرطب. كما يجب تبريد عدد من الأنابيب وفق الحاجة لعملية التشريح مسبقاً باستخدام الثلج الجاف.

بعد التضحية بالجرذ، استخرج الدماغ وضعه مقلوباً بحيث يستقر المخيخ الجانبي في الشقوق الموجودة في القالب المبرد. وبعد مرور دقيقة، أدخل شفرات الحلاقة المبردة في الدماغ المبرد، بدءاً من مسافة 2 mm تقريباً من الناحية المنقارية للتصالب البصري لتحليل الجسم المخطط والنواة المتكئة. ثم استمر في إدخال شفرات الحلاقة المبردة عند كل مقطع بمقدار 1 mm حتى منتصف الجسور، مع مراعاة ترتيب وضع كل شفرة بشكل متدرج لتسهيل إزالتها من القالب.

عند سحب الشفرات، ابحث عن بداية الحصين (hippocampus) حيث إنه أفضل دليل لضمان وجود المادة السوداء (SN) والمنطقة السقيفية البطنية (VTA) في الموقع الذي يلتف فيه الحصين تماماً حول الدماغ المتوسط. خذ مقاطع باستخدام شفرة المشرط رقم 11 لتشريح المادة السوداء (SN) وفصلها عن المنطقة السقيفية البطنية (VTA) أولاً. قم بإزالة القشرة والحصين اللذين يعلوان هذه المنطقة.

بعد ذلك، قم بإجراء قطع رأسي لفصل المنطقة المصبوغة من الـ SN عن الـ VTA، مع التأكد من بقاء الشفرة في تلامس مستمر مع الثلج المبلل أثناء التشريح. ثم قم بإجراء قطع أفقي عند خط المنتصف أو بالقرب منه، فوق الجزء الظهري والجانبي الأكثر بروزاً من الـ sn مباشرة. وأخيراً، قم بفصل الـ SN عن بقية جذع الدماغ.

بمجرد إزالة SN، افصل VTA عن بقية الدماغ المتوسط. ضع الأنسجة المشرحة في أنابيب طرد مركزي دقيقة مبردة مسبقاً على الفور. ثم خزن الأنسجة عند درجة حرارة -80 °C حتى تصبح جاهزة للمعالجة.

في هذا الإجراء، قم بتجانس الأنسجة بلطف فور إخراجها من الثلج الجاف باستخدام محلول 0.1 molar per chloric acid EDTA المبرد بالثلج. بعد ذلك، احفظ العينة على الثلج الجاف مرة أخرى. بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 12, 000 RPM للترسيب.

يتم استخدام راسب البروتين في تقديرات western blot، ثم تُسحب السوائل الطافية لاحقاً إلى أنبوب HPLC. تُوضع رواسب البروتين المترسبة والمجمدة، والتي تم الحصول عليها من معالجة منظم HPLC، على ثلج مبلل لإذابتها، مع التأكد من إزالة جميع المنظمات وأرشفتها. ولمعالجة SN ثنائية الجانب، يُضاف 300 µL من 1%SDS الذي يحتوي على 5 mM triss و 1 mM EDTA إلى الراسب ثم يتم إجراء عملية السونيكة، بينما يكفي إضافة 200 µL من 1%SDS لمعالجة VTA ثنائية الجانب.

بعد ذلك، ضع العينات في الماء المغلي لمدة خمس دقائق تقريبًا لإتمام عملية تمسخ البروتين. ثم اتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من إحكام غلق الأغطية في هذه الخطوة. بعد ذلك، استخدم مقايسة BCA مع منحنى قياسي للبروتين يتراوح من 2 إلى 40 micrograms من البروتين.

لتحديد تركيز البروتين في عينات الـ 5 µL، استخدم القيمة الوسيطة المستمدة من تحليل ثلاثي لتحديد كمية البروتين مقابل المنحنى القياسي. اقسم النتيجة على حجم العينة لاستخراج تركيز البروتين. بعد ذلك، قم بتحضير العينات باستخدام منظم العينات الذي يحتوي على DIO three etol لإجراء الفصل الكهربائي بـ SDS المختزل على هلام أكريلاميد بنسبة 10% إذا لزم الأمر، وفقاً لما يشير إليه لون منظم العينات.

يتحول اللون إلى الأصفر، أضف تركيز 1 molar من tris base بـ pH 8.2 إلى العينة بزيادات قدرها 10 microliter حتى يظهر اللون الأزرق. ولضمان درجة pH المناسبة، قم بتشغيل الكمية المناسبة من البروتين الكلي باستخدام SDS page على هلام acrylamide بتركيز 10%، ثم انقل البروتينات إلى Nitrocellulose بمسام حجمها 0.45 micron، واضبط خزان hoffer على 27 volts على الأقل واترك عملية النقل تتم طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم تجفيف اللطخة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم تُصبغ باستخدام محلول ponceau S لمدة خمس دقائق تقريبًا. بعد ذلك، تُغسل بقوة باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.2% حتى تظهر حزم البروتين الفردية بوضوح ويتم إزالة صبغة الخلفية.

بعد ذلك، يتم الحصول على صورة لصبغة poncho S باستخدام برنامج image J من أجل زيادة تقدير كمية أحمال البروتين النسبية في كل ممر ومعايرة نتائج tyrosine hydroxylase أو dopamine transporter أو vesicular monoamine transporter two. يظهر هنا تحليل western blot لـ Syrian 31 phosphorylated tyrosine hydroxylase في عينات المادة السوداء للفأر. يتراوح منحنى Syrian 31 phosphorylated tyrosine hydroxylase القياسي المعاير من 0.3 nanograms إلى 2.0 nanograms، وهو ضمن النطاق الخطي للكشف. وهنا يظهر تحليل western blot لـ Syrian 40 phosphorylated tyrosine hydroxylase في عينات المنطقة السقيفية البطنية للفأر.

يتراوح منحنى المعايرة القياسي لـ SN 40 لإنزيم tyrosine hydroxylase المفسفر من 0.2 nanograms إلى 1.5 nanograms، وهو يقع ضمن النطاق الخطي للكشف. ويعد الحفاظ على درجة الحرارة المناسبة أمراً هاماً، بالإضافة إلى وضع ملصقات تعريفية على الأنابيب. ومن المهم أيضاً إجراء تسوية للبروتين (normalize protein) لتقليل التباين في نتائجك.

يمكن لهذا البروتوكول، عند اتباعه بدقة، أن يمنح الباحثين في مجال الوظيفة الحركية وسلوك الإدمان قراءات جزيئية واسعة النطاق تؤثر على تنظيم mono mean والدماغ، وبشكل خاص الدوبامين، وهو الأمر الذي نهتم به. ونتيجة لذلك، يمكن لهذه القراءات أن تقدم تحليلاً مفصلاً وشاملاً لما يعنيه ذلك بالنسبة للنتائج السلوكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق أقصى قدر من قراءات تنظيم monoamine في المادة السوداء والمنطقة السقفية البطنية من خلال تشريح نسيجي واحد.