A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج وتصور وإحصاء الخلايا من اليرقات البرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير اليرقة أولا عن طريق وضعها على الجليد ، وحقنها بمحلول عازل يحتوي على مضاد للتخثر وإعادة اليرقة إلى الجليد للسماح للخلايا بالعودة إلى الدورة الدموية قبل الاستخراج. الخطوة الثانية هي عمل شق ضحل في الطرف الخلفي من اليرقة باستخدام مشرط نظيف.

بعد ذلك ، يتم ضغط اليرقة برفق باستخدام ملقط ناعم. ثم يتم شفط مزيج الليمفاوية الدموية للمحلول العازل باستخدام ماصة دقيقة ويتم تجميعها في أنبوب طرد مركزي صغير. تتمثل الخطوة الأخيرة في خلط المحلول الليمفاوي الدموي برفق مع حجم متساو من المحلول العازل ونقل 10 ميكرولترات من المحلول إلى مقياس الخلوي الدموي لتصور وحساب عدد الخلايا الدموية.

في النهاية ، يمكن استخدام طريقة استخراج الخلايا الدموية هذه كطريقة سريعة وفعالة لحساب الخلايا من أنواع اليرقة المختلفة وحفظها كأداة لفحص الجوانب الفسيولوجية للاستجابة المناعية الخلوية للحشرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لاستخراج hemo sots من اليرقات ذات البروكس المنخفض للغاية. يتم نزيف نماذج اليرقات الأخرى عن طريق قطع أحد المحترفين ، واستخراج unex من السائل الذي يخرج.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لاستخراج النمط الدموي من أنواع الحشرات الأخرى. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة البيئية ، مثل كيفية اختلاف الاستجابة المناعية الخلوية للحشرات باختلاف جودة النظام الغذائي أو مرحلة النمو أو التعرض لمسببات الأمراض المختلفة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتخدير يرقات الطور قبل الأخير عن طريق تبريدها على الجليد لمدة 20 دقيقة قبل استخراج الخلايا الدموية.

بعد ذلك ، قم بتركيب الطرف الحاد لإبرة شعرية نظيفة عيار 16 في الأنبوب المتصل بحقنة زجاجية سعة 20 مل. اترك الأنبوب الذي يحتوي على محلول التجميع مفتوحا على مقعد المختبر. املأ الشعيرات الدموية ببطء بحوالي 10 إلى 15 ميكرولتر عازلة.

ثم ضع الإبرة على كرة من الطين توضع بجوار مجهر التشريح. ضع اليرقة في طبق بتري. يجب وضع الحشرة على جانبها بحيث تكون الكرويات مرئية بوضوح.

أثناء المشاهدة تحت مجهر تشريح ، أمسك اليرقة في مكانها باستخدام زوج من الملقط وضع الإبرة بالقرب من أحد الكرات حيث تكون بشرة الحشرة أكثر نعومة بشكل عام. ثم اضغط برفق على الإبرة الشعرية على جسم الحشرة. بمجرد اختراق الإبرة للبشرة ، قم بحقن الحجم الكلي للمحلول في اليرقة.

سوف ينتفخ جسم اليرقة بعد الحقن ، لكن لا ينبغي أن ينفجر أو ينضح. أعد اليرقة إلى طبق بتري المثلج. ضع الحشرة ظهريا لمنع تسرب المخزن المؤقت من الجرح.

كرر الحقن لكل كاتربيلر تستخدم لاستخراج العرج الدموي. ثم اترك جميع الحشرات تبرد على الجليد لمدة 30 دقيقة. الآن ، ضع اليرقة في طبق بتري تحت المجهر التشريح.

قم بعمل شق ضحل بعناية بطول حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات في المنطقة الخلفية من اليرقة ، باستخدام مشرط معقم دون الإضرار بالأمعاء أو الأعضاء الداخلية الأخرى. بعد ذلك، اضغط على اليرقة برفق باستخدام زوج من الملقط البلاستيكي المرن أثناء جمع ما يقرب من 10 إلى 20 ميكرولترا من مزيج الهيمو العرج بطرف ماصة سعة 10 ميكرولتر. مرة أخرى ، احرص على عدم إصابة الأنسجة الداخلية.

بعد ذلك ، تخلص من بقايا اليرقات. اجمع العرج الدموي من كل كاتربيلر في أنابيب طرد مركزي صغيرة منفصلة تحمل علامة السيليكون سعة 0.5 مل. ثم أضف ما يقرب من 10 إلى 20 ميكرولترا من محلول الحضانة إلى كل عينة يعرج من الهيمو التي تم جمعها من كاتربيلر فردي.

احتفظ بعينات الهيموليمف على الجليد في جميع الأوقات في هذه الخطوة. امزج عينة الهيموليمف ومحلول الحضانة مباشرة قبل العد. هو cytes.

يسمح هذا العلاج بالفصل الصحيح للخلايا ويمنع التكتل. استخدم طرف ماصة نظيف لنقل 10 ميكرولترات من عينة الليمفاوية الدموية الممزوجة بمحلول الحضانة إلى مقياس الخلوي الدموي. ثم باستخدام مجهر مركب ، قم بحساب عدد المربعات في 15 على الأقل من المربعات الكبيرة للشبكة المركزية لمقياس الخلوي الدموي.

أضف هذه القيم للحصول على مجموع إجمالي لعدد السيات الدموية في 15 مربعا. بعد ذلك ، اشطف مقياس الخلوي الدموي وغطاءه جيدا باستخدام زجاجة غسيل بالماء المقطر ومنزوع الأيونات. ثم امسحها حتى تجف بمناديل كيم.

كرر الإجراءات لبقية عينات hemo lemp واحسب متوسط عدد الcytes لكل مليلتر من حجم hemo limp لكل كاتربيلر. تظهر صورة الفحص المجهري للحقل الساطع السيات المستخرجة من اليرقات النووية بمعدل تكبير 20 ×. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا الدموية التي تم جمعها لدراسة الاستجابة المناعية الخلوية وإعداد فحوصات مثل البلعمة والغطاء ، واختيار التغليف ونشاط أوكسيديز الأس الهيدروجيني.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع R-N-A-D-N-A والبروتين غير مستخدمين لمزيد من المقايسات من أجل دراسة هذه الاستجابة المناعية الخلوية في الحشرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن اليرقات لغرض استخراج الهيموليمف وكيفية جمع الهيموليمف الذي يحتوي على خلايا hemo الحية.