والطريقة وكالة حماية البيئة معدلة 1623 يستخدم تماسي تدفق الجوف الألياف الترشيح الفائق والحرارة خطوات تمييز لكشف تنتقل عن طريق الماء

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن أنواع الكريبتوسبوريديوم والجيارديا المنقولة بالمياه وتصويرها. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تركيز عينة المياه باستخدام الترشيح الفائق بالألياف المجوفة والتدفق المماسي. وتتمثل الخطوة الثانية في استخلاص الكائنات الحية واحتجاز الرواسب من المرشح بعد خطوة الطرد المركزي.

يتيح الفصل المناعي المغناطيسي الفصل الانتقائي للطفيليات عن الحطام المركز. يتم فصل الخرزات المغناطيسية عن الطفيليات عن طريق التفكيك الحراري وإزالتها باستخدام مغناطيس. بعد ذلك، توضع الأكياس والـ O cysts على شريحة، وتُصبغ العينة للتصور بواسطة مجهر التألق المناعي.

تتمثل الميزة الرئيسية لترشيح hofi مقارنة بالتقنيات الحالية في أن المرشح الفائق أقل تكلفة بكثير، كما أنه يلتقط العديد من الكائنات الدقيقة بالإضافة إلى Cryptosporidium و Giardia، مثل الفيروسات والبكتيريا. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في عملية الفصل المناعي تحديات تتعلق بكمية ونوع الرواسب المصاحبة لعينات مختلفة مستمدة من ظروف مناخية متنوعة. ابدأ بتجميع جهاز الترشيح الفائق داخل خزانة السلامة البيولوجية.

بعد التجميع، يعمل الجهاز على النحو التالي: تدخل عينة المياه إلى النظام عبر الموصل T الأسود، ثم تنتقل عبر رأس المضخة ومقياس الضغط وصولاً إلى مرشح الألياف المجوفة فائق الترشيح، حيث تخرج المياه المفلترة من جانب المرشح إلى حاوية النفايات. أما المياه المحتجزة التي تحتوي على الكائنات الحية فتُدفع إلى زجاجة الاحتجاز ويُعاد تدويرها عبر النظام حتى يتم تقليل حجم المياه. لبدء الإجراء، قم بإزالة غطاء التهوية وافتح جميع المشابك باستثناء المشبك الضاغط الثاني، الذي يجب أن يظل مغلقاً للسماح بملء زجاجة الاحتجاز بالمياه، ثم اضبط اتجاه المضخة بحيث تتدفق عينة المياه إلى المرشح.

بعد ذلك، اضبط سرعة المضخة على 25% وقم بتشغيل المضخة عندما تكون زجاجة الـ renate ممتلئة بمقدار الثلثين. أغلق المشبك الثاني وأحكم إغلاق الزجاجة بسرعة باستخدام غطاء التنفيس. افحص جميع الخطوط والوصلات للتأكد من عدم وجود أي تسريبات.

بعد ذلك، قم بزيادة سرعة المضخة ببطء لتصل إلى حوالي 1.5 liters per minute باستخدام مخبار مدرج ومؤقت أو مقياس تدفق، وتحقق من أن معدل الترشيح (أي معدل خروج المياه من خط التدفق الخارج) هو بالفعل 1.5 liters per minute. راقب عملية الترشيح لضمان عدم فراغ زجاجة الاحتجاز (reten bottle) تماماً، على الرغم من أن الحجم قد يزداد أو ينقص قليلاً. إذا انخفض الحجم إلى أقل من الثلث، قم بإزالة غطاء التهوية وإغلاق ملقط الضغط الثاني.

مرة أخرى، اسمح للحجم في الزجاجة بالزيادة حتى يصل إلى الثلثين. بعد ذلك، أعد تركيب غطاء التهوية بإحكام وافتح المشبك الثاني مجدداً. بمجرد أن تصبح حاوية العينة فارغة، أغلق مشبك الضغط الأول على الفور وقم بخفض سرعة المضخة إلى 20%. قم بإزالة غطاء التهوية من زجاجة المواد المحتجزة وأغلق مشبك المنحدر الذي يربط أنبوب تدفق عمود الترشيح بخزان النفايات.

قم بشد أو إرخاء مشبك المنحدر لضبط الحجم في زجاجة المادة المحتجزة إلى حوالي 200 milliliters. بعد ذلك، أحكم شد مشبك المنحدر لمحلول الاستخلاص لاستخلاص العينة. أولاً، أضف 500 milliliters من محلول الاستخلاص إلى وعاء العينة، مع شطف الجزء الداخلي من الوعاء أثناء هذه العملية.

بعد ذلك، ضع الماصة سعة 10 milliliter المتصلة بخط سحب العينة في وعاء محلول الشطف. افتح مشبك الضغط الأول وأغلق مشبك الضغط الثاني لفترة وجيزة لسحب محلول الشطف. وبمجرد تحميل المحلول بالكامل، أغلق مشبك الضغط الأول، وافتح مشبك الضغط الثاني واترك المحلول يدور لمدة خمس دقائق بسرعة مضخة تبلغ 20%، ثم أحكم ربط أو أرخِ مشبك المنحدر لضبط حجم العينة في زجاجة الارتشاح لتصل إلى حوالي 100 milliliter.

بعد ذلك، أحكم ربط مشبك المنحدر تماماً واترك العينة لتدور مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة. وعند هذه النقطة، اعكس اتجاه المضخة لمدة 20 ثانية، مما سيؤدي إلى تراكم حوالي 225 milliliters من العينة في زجاجة tate.

بعد ذلك، أوقف تشغيل المضخة. قم بإزالة الأنابيب من رأس المضخة والأنابيب الخارجة من المرشح، وأمسك بالأنابيب فوق زجاجة tate لإجبار أي عينة متبقية على الدخول إلى الزجاجة. ثم افصل جميع الأنابيب عن الزجاجة واستبدل غطاء التهوية بغطاء غير مهوى.

انقل العينة المركزة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 250 milliliter. اشطف زجاجة التجميع مرتين باستخدام 10 milliliters من ماء الكواشف وانقل سائل الشطف إلى أنبوب الطرد المركزي. قم بطرد العينة مركزياً بسرعة لا تقل عن 1500 times G لمدة 15 minutes.

لا تستخدم خاصية التوقف التدريجي (break) لإيقاف عملية الطرد المركزي. بعد انتهاء الطرد المركزي، قم بسحب السائل الطافي بعناية حتى تبقى مسافة خمسة مليلترات فوق الراسب. يجب توخي الحذر الشديد للبقاء عند مستوى السطح العلوي للسائل وتجنب سحب الـ O cysts أو الكيسات الموجودة داخل الراسب.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الـ Vortex لإعادة تعليق الراسب جيداً. ثم انقل العينة إلى أنبوب dyal L 10 مسطح الجوانب يحتوي على ملليلتر واحد من كل من 10 X SL buffer A و buffer B. اشطف أنبوب الطرد المركزي مرتين باستخدام 2.5 ملليلتر من الماء الكاشف وأضف محلول الشطف إلى أنبوب dyal L 10. مع رفع الحجم النهائي إلى 12 ملليلتر، أضف 100 ميكرولتر من كل من الأجسام المضادة لـ cryptosporidium و giardia المقترنة بحبيبات مغناطيسية إلى الأنبوب.

بعد ذلك، قم بتدوير الأنبوب بسرعة 18 RPM لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط دوار. ضع الجانب المسطح من الأنبوب مقابل مغناطيس MP six وقم بهز الأنبوب بلطف لمدة دقيقتين دون إزالته من المغناطيس. ابقِ الجانب المسطح للأعلى وقم بسحب السائل الطافي.

مع الحرص على عدم تحريك الحبيبات المستبقىة على الجانب المسطح من الأنبوب بالقرب من المغناطيس، قم بإزالة أنبوب العينة من المغناطيس واغسل الجانب المسطح من الأنبوب ثلاث مرات باستخدام 500 µL من المنظم A، مع تجنب الرواسب الموجودة على الجانب المستدير من الأنبوب. انقل كل حجم غسيل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL مثبت داخل مغناطيس MPCS.

مع وضع المغناطيس في الوضع العمودي، أغلق الأنبوب ورجّه بلطف لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، ومع بقاء المغناطيس في مكانه، اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة باستير يتم وضعها عند قاع الأنبوب، ثم أضف بلطف 1 mL من PBS إلى الأنبوب.

احرص على عدم تعكير راسب الخرزات. قم بتثبيته على جدار الأنبوب المجاور للمغناطيس. أزل الشريط المغناطيسي وهز الأنبوب برفق حتى يتم إعادة تعليق الخرزات.

أعد إدخال الشريط المغناطيسي في الوضع العمودي. قم بهز الأنبوب بلطف لمدة دقيقة واحدة وقم بشفط السائل الطافي، مع إزالة أكبر قدر ممكن من الرواسب دون تحريك الخرزات. بعد عملية الغسل هذه، قم بإزالة المغناطيس وأضف 50 µL من ماء الكاشف مباشرة على لوحة الخرزات.

قم برج الأنبوب بواسطة جهاز الـ Vortex بالسرعة القصوى لمدة 50 ثانية لإعادة تعليق الخرزات. ثم قم بحضن العينة عند درجة حرارة 80 °C لمدة 10 دقائق، وذلك للسماح لأكياس Giardia وأكياس cryptosporidium o بالانفصال عن الخرزات. بعد انتهاء فترة الحضن، قم برج العينة بواسطة جهاز الـ Vortex لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، ضع الشريط المغناطيسي في جهاز MPCS باستخدام الوضع المائل لفصل الخرزات عن الأكياس وأكياس O المعلقة.

انقل الطافي الذي يحتوي على الأكياس والأكياس من النوع O إلى شريحة ذات تجاويف. كرر خطوات إضافة الماء والرج بجهاز الفورتكس والتفكك الحراري مرة ثانية مع إضافة الطافي إلى الشريحة نفسها. ثم ضع الشريحة على مسخن شرائح بدرجة حرارة 37 degrees Celsius لتجفيف المعلق.

ابدأ بوضع 50 µL من الميثانول على الشريحة لتثبيت العينة واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول DPI واحضن الشريحة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ولصبغ النوى، استخدم مناديل Kim لامتصاص السائل من البئر مع الحرص على عدم لمس البئر.

ثم أضف 50 µL من صبغة easy stain لصبغ الجدار الخلوي لأكياس Giardia وأكياس cryptosporidium o. حضّن العينة عند 35 °C لمدة 30 دقيقة. أزل الصبغة باستخدام منديل Kim wipe كما سبق.

ثم أضف ببطء 300 µL من منظم التثبيت البارد easy stain fixing buffer عن طريق وضع طرف الماصة بعناية خارج البئر والسماح للسائل بالانتقال إلى داخل البئر. قم بتحضين الشريحة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة المنظم باستخدام منديل kim wipe وضع 10 µL من وسط التثبيت mounting medium، ثم ضع غطاء الشريحة برفق فوق العينة مع إزالة أي فقاعات، وأغلق غطاء الشريحة باستخدام طلاء أظافر شفاف. وباستخدام مجهر فلوري، افحص الشريحة بتكبير يتراوح من 200 x إلى 1000 x وباستخدام مرشح fse ثم DPI بتكبير 200 x؛ حيث تظهر الأكياس وأكياس O cysts كهياكل بيضاوية ذات فلورة خضراء تفاحية ساطعة مع حواف محددة بوضوح.

تكون أكياس Cryptosporidium O مستديرة وتتراوح أحجامها بين 4 إلى 6 ميكرون. أما أكياس Giardia فهي أكبر حجماً، حيث يتراوح عرضها من 5 إلى 15 ميكرون وطولها من 8 إلى 18 ميكرون، ويمكن أن تكون مستديرة أو بيضاوية عند تكبير 1000x. وباستخدام مرشح DPI، يمكن رؤية البنية الداخلية للأكياس وCYS بشكل أفضل.

عادةً، يمكن رؤية ما يصل إلى أربعة سبوروزويتات (sporozoites) داخل أكياس Cryptosporidium O وGiardia Cys.DIC، حيث تظهر نواتها مصبغة باللون الأزرق السماوي باستخدام صبغة DPI. كما يمكن أن يساعد الفحص المجهري في التحديد الصحيح للطفيليات، حيث يمكن ملاحظة خصائص مورفولوجية إضافية. قد تكون سبوروزويتات Cryptosporidium مرئية عبر تقنية DIC، بينما غالبًا ما تظهر أكياس Giardia بنية داخلية واحدة أو أكثر يمكن تمييزها، مثل النوى المرئية، وعضيات على شكل هلال تسمى الأجسام المتوسطة (median bodies)، وبنى سوطية داخلية تسمى المحاوير (axons).

من المهم ملاحظة أن إجراء الترشيح الفائق باستخدام ألياف holo لديه القدرة على التقاط كائنات دقيقة متعددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق فحوصات كشف أخرى مثل QPCR والنمط الجيني على العينات المركزة، مما يجعل هذه الطريقة أكثر مرونة وقابلية للتكيف مع تطبيقاتكم. نشكركم على المشاهدة، ويرجى إعلامنا إذا كان لديكم أي استفسارات.