إصلاح نموذج الحرجة الحجم عيب قبي طريق الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية المقطوع Lipoaspirate

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد الخلايا السدوية متعددة القدرات من النسيج الدهني لغرض التمايز العظمي، باستخدام نموذج عيب في القحف داخل الجسم الحي في الفأر. يتم تحقيق ذلك من خلال عزل الخلايا السليفة أولاً من الطبقة الوعائية السدوية للنسيج الدهني، والتي يمكن الحصول عليها بعد عملية شفط الدهون. وتتمثل الخطوة التالية في تحضير هيكل ثلاثي الأبعاد ثم استزراع الخلايا على تلك السقالة.

تتمثل الخطوة النهائية في إنشاء عيب قحفي بحجم حرج في نموذج جرذ، حيث يتم وضع السقالات والخلايا بداخله. وفي الختام، تظهر النتائج أن الخلايا السدوية متعددة القدرات المعزولة من النسيج الدهني تمتلك القدرة على التجديد الهيكلي في الجسم الحي. وتتمتع تطبيقات هذه التقنية بنطاق واسع من التطبيقات السريرية المحتملة نظرًا للنقص في الأنسجة المتاحة للتجديد الهيكلي.

بينما تُعد الطعوم العظمية الذاتية هي المعيار الذهبي، إلا أن نقص مواقع المانحين والمضاعفات المرضية في موقع المانح تحد من هذا الخيار. ويمكن استخدام الطعوم الخيفية والمواد الغريبة، ولكنها تظل محدودة بسبب التكلفة، وضعف الاندماج، واحتمالية الإصابة بالعدوى.

إن الاستخدام المحتمل للأنسجة الدهنية لعزل الخلايا السلفية من أجل هندسة الأنسجة الهيكلية هو أمر مثير للاهتمام. سأقوم أنا ومايكل تشونج من مختبر long anchor بتوضيح هذا الإجراء. أولاً، يتم الحصول على أنسجة دهنية تحت الجلد بشرية من إجراءات شفط الدهون الاختيارية.

لاحظ وجود طبقتين في المادة المشفوطة من الدهون؛ حيث تحتوي الطبقة العلوية على الغالبية العظمى من المواد الخلوية المعالجة، بينما تتكون الطبقة السفلية في الغالب من المحلول الملحي المحقون.

يمكن حصاد الخلايا السدوية المشتقة من الأنسجة الدهنية من أي من الطبقتين، ولكن يكون المردود أكبر بكثير من الطافي. لعزل الجزء الوعائي السدوي أو SVF، اغسل المادة المشفوطة من الدهون بشكل مكثف بأحجام متساوية من المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات بتركيز 1x أو PBS يحتوي على 2.5% Betadine، ثم اشفط حجماً مساوياً من 1XPBS الخالي من Betadine. اترك عملية الغسل لتترسب.

تأكد من الحفاظ على التقنية المعقمة طوال العملية لتجنب التلوث بالأنسجة البشرية المعالجة. بعد ذلك، قم بشفط الطبقة السفلية والتخلص منها بعد كل عملية غسيل، ثم انقل 15 milliliters من النسيج الدهني إلى أنابيب Falcon المخروطية سعة 50 milliliter. ثم قم بهضم النسيج الدهني في 15 milliliter من محلول 0.075% المصفى.

أضف إنزيم الكولاجيناز من النوع الثاني في محلول هانك الملح المتوازن (HBSS) عند درجة حرارة 37 °C في حمام مائي لمدة 60 دقيقة مع التقليب المستمر، مع الحرص على تهوية الأنابيب كل 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بمعادلة نشاط الإنزيم باستخدام 15 milliliters من محلول PBS المحتوي على 10% من مصل الجنين البقري (FBS) ثم قم بالطرد المركزي. للحصول على قرص عالي الكثافة من الجزء الوعائي (SVF)، سيكون القرص خليطاً من الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية وكريات الدم الحمراء.

تخلص أولاً من طبقة الدهون الطافية، ثم تخلص من الطبقة السائلة الطافية دون تعكير الراسب. أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط النمو التقليدي. بعد ذلك، ادمج محتويات ثلاثة أنابيب في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 milliliter عبر مرشح بمسامية 100 micron ثم قم بالطرد المركزي.

تخلص من السائل الطافي دون تعريض الراسب للتفكك، ثم أعد تعليق الراسب. في 5 mL من وسط نمو تقليدي، ادمج أنبوبين مخروطيين سعة 50 mL لكل طبق بقطر 10 cm، أو خمسة أنابيب مخروطيين سعة 5 mL لطبق واحد بقطر 15 cm. قم بإنشاء المزارع الأولية طوال الليل عند 37 °C مع 21% oxygen و5% carbon dioxide.

بعد التحضين طوال الليل، تُغسل الأطباق بـ PBS لإزالة خلايا الدم الحمراء المتبقية غير الملتصقة. تكون المجموعات الخلوية الناتجة عبارة عن خلايا سدوية مشتقة من النسيج الدهني. يتم الحفاظ على الخلايا عند مستويات دون الاندماج لمنع التمايز التلقائي.

عند درجة حرارة 37 °C، و21% oxygen، و5% carbon dioxide. في أوساط النمو، تحتاج الخلايا عموماً إلى التقسيم كل ثلاثة إلى أربعة أيام في أوساط نمو عادية. عند زراعتها بنسبة تلاقي 50% confluence، يتم تحضير السقالة كما هو موضح في المخطوطة المرفقة.

عندما تصل الخلايا إلى مستويات ما دون الالتحام الكامل، اغسل الخلايا بمحلول PBS مرتين ثم استخدم التريبسين. قم بعدّ الخلايا لتقدير كميتها. ولعملية الاستزراع، استعد لاستزراع الخلايا على سحبائل مقصوصة مسبقاً بقطر 4 مم وبكثافة 1.5 × 10⁵ خلية.

ضع سِقالة واحدة في بئر واحد من لوحة ذات 96 بئراً، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط نمو عادي بتركيز يبلغ تقريباً 1.5 × 10⁵ خلية لكل 20 µL من الوسط. استزرع السقالة عن طريق نقل 20 µL من المحلول مباشرة إلى السقالة باستخدام الماصة، ثم ضعها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، أضف 200 µL من الوسط الغذائي واترك الخلايا تحضن على السقالة طوال الليل. قبل إجراء الجراحة، ليس من الضروري التأكد من التصاق الخلايا بالسقالة كما هو الحال في عملية الاستزراع؛ إذ يضمن وجود عدد كافٍ من الخلايا أن تلتصق غالبيتها بالسقالة.

بعد تخدير فأر بالي من نوع CD one nude يبلغ من العمر 60 يوماً، يتم تعقيم موقع الجراحة باستخدام Betadine والكحول ثلاث مرات، ووضع مادة مزلقة على عيني الفأر. بعد ذلك، يتم إجراء شق سهمي في خط منتصف فروة رأس الفأر للكشف عن العظم الجداري الأيمن. ثم يتم إزالة السمحاق من العظم الجداري الأيمن عن طريق الكشط غير الحاد.

بعد ذلك، قم بإحداث عيب أحادي الجانب بكامل السماكة وبقطر 4 mm في العظم الجداري الأيمن بعيداً عن مناطق الدرز. وباستخدام ريشة مثقاب ذات أسنان مطلية بالألماس، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب إصابة الأم الجافية الكامنة، حيث أن سماكة جمجمة الفأر تقل عن 0.3 mm قبل الزرع. اغسل السقالات بمحلول PBS معقم لمنع انتقال عوامل النمو المشتقة من الوسط الزرعي.

ضع السقالة داخل العيب. أخيراً، قم بخياطة الجلد لإغلاقه وراقب الحيوان وفقاً لبروتوكولات ما بعد الجراحة المعتمدة. أجرِ تصويراً مقطعياً ميكروياً (micro CT) للفأر واحصل على صورة مُعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج microview.

استخدم برنامج Adobe Photoshop لضبط أحجام الصور لتكون بارتفاع موحد. عادةً، نقوم بقياس تجدد القحف كل أسبوعين. يتم تخدير الفئران أثناء الفحص من أجل المتابعة طويلة الأمد، ثم يتم القتل الرحيم لها في النهاية.

للتحليل النسيجي، استخدم ميزة العصا السحرية (magic wand) لقياس بكسلات عيب القحف. حدد نسبة التئام العيب من خلال صور الأشعة المقطعية (CT) اللاحقة. قم بقياس مساحة عيب القحف وتحديد عدد البكسلات وقسمتها على عدد بكسلات العيب الأصلي، ثم صبغ مقاطع متعددة على طول مدى العيب باستخدام صبغات نسيجية مثل aniline blue و pen aro للإشارة إلى تكون العظم.

استخدم برنامج adobe Photoshop لقص جميع المناطق التي لا تقع ضمن عيب القحف، واستخدم أداة "العصا السحرية" (magic wand) لتحديد عدد البكسلات الخاصة بتكوين العظم الجديد (de novo) في منطقة العيب، ثم قارن هذه النتائج بالمجموعات الضابطة أو المتغيرات الأخرى الموضحة. فيما يلي نظرة عامة على عمليات استخلاص وتطبيق المشفوط الدهني، بدءاً من عزل الخلايا السدوية المشتقة من الأنسجة الدهنية وصولاً إلى توسيعها وتمايزها واستخدامها في المختبر (in vitro) وفي الجسم الحي (in vivo). يظهر هنا تصوير مقطعي محوسب دقيق (micro CT) يوضح التئام عيب القحف ذي الحجم الحرج في الجسم الحي مع تطبيق الخلايا الجذعية السدوية (ASCs) عبر سقالة من الهيدروكسي أباتيت كما هو موضح في الصف السفلي.

تشمل مجموعات الضبط، الموضحة في الصف العلوي، عينات بدون سِقالة وعينات مصابة بخلل. ويوضح الصف الأوسط العينات المصابة بخلل مع وضع السِقالة بدون خلايا. يمثل LS الموضح هنا القياس الكمي للالتئام العظمي من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro ct)، والذي يظهر زيادة ملحوظة في الالتئام في مجموعة A SC.

توضح هذه الصورة النسيجية زيادة في تكوين العظم لدى مجموعة A SC من خلال andal. وباللون الأزرق، يظهر صبغ AROM لـ al. وباللون الأزرق، يُصبغ النسيج العظمي غير المتمعدن (osteoid) باللون الأزرق الداكن لـ pen arom.

تظهر صبغات العظم غير المتمعدن (osteoid) باللون الأصفر هنا وهي عبارة عن خلايا جذعية ميزنكيمية بشرية (ASCs) موسومة ببروتين الفلورة الأخضر (GFP)، حيث تم استزراعها على ساندة (scaffold) وتم التضحية بها بعد مرور أسبوعين. أُجري التلوين باستخدام جسم مضاد موسوم بـ GFP لإظهار مساهمة الخلايا البشرية في التجدد في منطقة العيب. ويظهر هنا الكيمياء النسيجية المناعية للمستضد النووي البشري التي توضح انتشار الخلايا البشرية في منطقة العيب بعد أسبوعين.

بمجرد إتقان العملية، يمكن معالجة الأنسجة الدهنية في غضون أربع ساعات، وقد تستغرق العملية الجراحية حوالي 10 دقائق لكل فأر. ومن المهم تذكر أن العظم الجداري مستدير بينما تكون المثاقب مسطحة، لذا يجب توخي الحذر لاختراق المحيط الكامل للثقب الذي يبلغ قطره أربعة مليمترات. تذكر التحرك ببطء لتجنب إصابة الأم الجافية في الدماغ.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا السلفية من النسيج الدهني، وكيفية استزراع هذه الخلايا على سِقالة وزرعها في الفأر.