سد واجهة الحيوية الالكترونية مع Biofabrication

الهدف العام من التجربة التالية هو ترسيب أغشية بوليمرية حيوية كهربائياً ووظيفيتها بمكونات بيولوجية مثل البروتينات والخلايا. ويتم تحقيق الترسيب الكهربائي من خلال الاستفادة من تغير pH الذي يحدث موضعياً عند قطب كهربائي منحاز بالتزامن مع محلول بوليسيكاريد مستجيب لـ pH. وعند اختيار استراتيجية ترسيب كاثودية أو أنودية، يتم منحاز القطب الكهربائي لتحفيز انتقال من الحالة السائلة إلى الهلام (sol-gel transition)، مما يؤدي إلى تكوين غشاء رقيق بنمط تحدده الهندسة الكهربائية.

علاوة على ذلك، يمكن إدخال المكونات البيولوجية مثل البروتينات والخلايا خلال عملية الترسيب على القطب الكهربائي. ومن أجل إضفاء الوظيفية البيولوجية على الغشاء، تم الحصول على نتائج تظهر تموضع المكونات البيولوجية على الأغشية بناءً على التصوير الفلوري. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه المكونات وظيفية وقادرة على التفاعل مع بيئتها، وهو ما ثبت من خلال الكشف الكهركيميائي عن النشاط الإنزيمي واستخدام استجابة الخلايا المراسلة.

توفر التصنيع الحيوي (Biofabrication) مجموعة أدوات مبتكرة لبناء الواجهة بين البيولوجيا والإلكترونيات. ونعتقد أن مزاياه الرئيسية تكمن في بساطته وقدرته على التجميع في ظروف قريبة من الظروف الفسيولوجية. وتتميز البيولوجيا بخبرتها في التصنيع على مقياس النانو من خلال التجميع الذاتي والوسائل الإنزيمية؛ ومن خلال الاستعانة بهذه القدرات، نتجنب طرق التصنيع المعقدة والخطيرة والمستهلكة للوقت التي تستخدمها تقنيات التجميع الأخرى.

جاءت فكرة فريقنا التعاوني لبناء واجهة جهاز BioD باستخدام مواد وآليات بيولوجية عندما لاحظنا إمكانية ترسيب الكيتان كهربائياً. الكيتان عبارة عن بوليساكاريد مكون للأغشية يستجيب لدرجة الـ pH، ويمكنه التعرف على الإشارات الكهربائية التي يفرضها الجهاز والترسب على شكل غشاء رقيق. وبمجرد أن رأينا أن الكيتان يمكن ترسيبه كهربائياً، أدركنا أن بإمكاننا الاستفادة من مجموعة أوسع من أدوات الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لبناء واجهة جهاز BioD.

يمتد تطبيق هذه التقنية نحو إعدادات المختبر على رقاقة (lab-on-a-chip) حيث تكون المكونات البيولوجية الوظيفية مطلوبة، لأنها توفر طريقة رخيصة وسهلة لتوطين هذه المكونات على قطب كهربائي حيث يمكنها أن تظل حيوية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن الغشاء المصنع حيوياً يمكن أن يكون دقيقاً وسهل التلف. وبناءً على ذلك، يجب توخي الحذر لتجنب القسوة الزائدة أثناء غسل الغشاء أو شطفه.

بما أن الفيلم قد يكون عرضة للاضطراب بسهولة، فإن الميزة تكمن في إمكانية إعادة استخدام الأقطاب الكهربائية لأن الأفلام يمكن إزالتها بسهولة. لبدء هذا البروتوكول، قم بتوصيل مصدر الطاقة بالأقطاب الكهربائية المصنعة خصيصاً عبر أسلاك توصيل باستخدام مشابك التمساح.

ستعمل شريحة زجاجية مغطاة بأكسيد القصدير والإنديوم أو ITO كمصعد أو قطب عامل، بينما ستعمل رقاقة البلاتين كمهبط أو قطب مقابل؛ ضع القطب بحيث يكون سطح ITO المراد وظيفته في مواجهة القطب المقابل، وبحيث يتم وضع سطح ITO إما رأسيًا ليتم غمسه في المحلول أو أفقيًا بحيث يمكن احتواء المحلول على السطح. بعد ذلك، قم بتحضير محلول ترسيب الألجينات عن طريق خلط 1% alginate و 0.5% calcium carbonate في ماء مقطر ومعالجة الخليط بالموصدة (autoclave). ثم قم بوضع علامة فلورية على الألجينات باستخدام Fluor spheres عن طريق الخلط والرج بجهاز الفورتيكس.

سيسمح ذلك بالتصوير الفلوري للغشاء الناتج. بعد التعقيم بالأتوكلاف، اغمر كلا القطبين في محلول الترسيب المُحضّر، ثم طبق كثافة تيار ثابتة قدرها 3 amps/m² لمدة دقيقتين. سيتغير الجهد في نطاق يتراوح بين 2 إلى 3 volts. بعد مرور دقيقتين، افصل القطب وأزل محلول الترسيب غير المستخدم. اشطف الغشاء برفق باستخدام كلوريد الصوديوم لإزالة الألجينات الزائدة.

يُحضن الفيلم لفترة وجيزة في كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar لتقوية الهلام. ثم يُحضن الفيلم في محلول التخزين المطلوب. انتقل بعد ذلك إلى تصوير الفيلم باستخدام المجهر الفلوري قبل الترسيب المشترك.

قم بتنمية مزرعة خلوية مرسلة للإشارة ومزرعة خلوية مستقبلة للإشارة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق بهذا الفيديو. بعد ذلك، قم بتحضير محلول ترسيب من الألجينات وكربونات الكالسيوم. اخلط المحلول مع كل مزرعة خلوية بنسبة واحد إلى واحد للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1%alginate و 0.5%calcium carbonate مع تخفيف الخلايا إلى حوالي نصف كثافة الاستزراع.

استخدم شريحة زجاجية منقوشة بقطبين من أكسيد القصدير المطعّم بالإنديوم (ITO) محاطين ببئر من بولي ثنائي ميثيل سيلان، وقطب Platinum مقابل. قم بتوصيل أحد قطبي ITO وقطب Platinum بمصدر طاقة. وكما سبق، اغمر الأقطاب في محلول الترسيب الذي يحتوي على الخلايا المستقبلة.

اضبط وحدة إمداد الطاقة على تيار ثابت بكثافة 3 amps/m²، حيث يتم تحديد أبعاد مساحة السطح بواسطة القطب الكهربائي الواحد الذي ستتم عليه عملية الترسيب. طبق التيار لمدة دقيقتين للسماح بالترسيب المشترك للخلايا في مصفوفة الألجينات. اشطف الغشاء بمحلول كلوريد الصوديوم كما سبق، ثم انقل التوصيل السالب إلى قطب ITO المجاور.

كرر إجراء الترسيب، ولكن في هذه المرة، قم بإضافة المحلول الذي يحتوي على الخلايا المرسلة. يتم تحضين الرقاقة ذات القطبين التي تحتوي على الخلايا المترسبة معاً وأرجنتات الكالسيوم طوال الليل عند 37 درجة مئوية في محلول ملحي منظم بالفوسفات.

مُدعّم بوسط LB بنسبة 10% وكلوريد الكالسيوم بتركيز 1 millimolar. بعد الحضانة، يتم تصوير الشريحة باستخدام مجهر فلوري لبدء ترسيب قطب الشيتوزان. قم بتوصيل مصدر الطاقة بالأقطاب الكهربائية.

قم بتوصيل مشابك التمساح. ستعمل شريحة سيليكون مطلية بالذهب ككاثود، بينما تعمل رقاقة البلاتين كأنود. ضع سطح قطب الذهب بحيث يواجه القطب المقابل كما في السابق.

قم بتحضير محلول رمل Kato عن طريق خلط رقائق رمل Kato في الماء وإضافة حمض الهيدروكلوريك بتركيز 2 molar ببطء لإذابة polysaccharides. باتباع الإجراء المذكور في النص، يمكن وسم محلول رمل Kato بصبغة فلورية من أجل تصوير الغشاء المترسب على القطب الكهربائي باستخدام المجهر الفلوري. بعد ذلك، ضع الأقطاب الكهربائية في محلول kaizan مع غمر المنطقة المراد الترسيب فيها بالكامل.

قم بتطبيق تيار ثابت لمدة دقيقتين، محسوب بكثافة أربعة أمبير لكل متر مربع بناءً على مساحة سطح القطب العامل. في هذه الحالة، يتم تطبيق تيار قدره 16 microamps على قطب ذهبي بمساحة أربعة مليمتر مربع، وسوف يتغير الجهد ضمن نطاق يتراوح من فولتيتين إلى ثلاث فولتات؛ بعد ذلك، اشطف القطب بالماء منزوع الأيونات لإزالة الشيتوزان الزائد. انتقل بعد ذلك إلى تصوير الغشاء باستخدام مجهر فلوري، حيث تم ترسيب الشيتوزان وglucose oxidase من محلول بكثافة تيار قدرها أربعة أمبير لكل متر مربع على قطب منقوش.

وفقاً لإجراء ترسيب قطب الشيتوزان، سيتم تكوين غشاء كايزان (kaizan) محتجز بداخله إنزيم جلوكوز أوكسيداز. قم بتوصيل القطب المعالج بنظام ثلاثي الأقطاب بحيث يكون هو القطب العامل، وسلك بلاتيني كقطب مقابل، وفضة/كلوريد الفضة كقطب مرجعي، ثم اغمر الأقطاب في محلول منظم من الفوسفات يحتوي على كلوريد الصوديوم. قم بربط البروتين كيميائياً وكهربائياً بغشاء الكازام (Kazam) عن طريق تطبيق جهد ثابت لمدة 60 ثانية باستخدام قياس الجهد الزمني (chrono pyrometry) بعد عملية الربط.

ضع الرقاقة في محلول منظم الفوسفات واغسلها لمدة 10 دقائق على هزاز مداري لإزالة أي كلوريد صوديوم غير متفاعل وجلوكوز أوكسيداز غير مقترن. أعد توصيل نظام الأقطاب الثلاثة واغمره في محلول جلوكوز بتركيز 5 millimolar. ثم حدد المعلمات المطلوبة للقياس عن بعد للفولتاميتري الحلقي لمسح الجهد في اتجاه موجب وصولاً إلى 0.7 volts.

قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من محلول الجلوكوز واشطفها باستخدام محلول منظم الفوسفات. ثم ضع الأقطاب الكهربائية داخل بيكر سعة 10 milliliter يحتوي على ثمانية milliliters من محلول منظم الفوسفات على قاعدة لوح تحريك مغناطيسي. اضبط الشريحة الوظيفية GOX على 0.6 volts لتعمل كقطب عامل.

بعد ضبط المعلمات المطلوبة، قم بتسجيل قراءة أساسية. أضف حصصاً من الجلوكوز إلى المحلول المنظم لزيادة تركيز الجلوكوز بمقدار 4 millimolar لكل حصة. في هذه التجربة، تُضاف حصص بحجم 400 µL من جلوكوز بتركيز 80 millimolar إلى المحلول المنظم. قم بربط تيار المخرج بكل تركيز من تراكيز الجلوكوز. ولإنشاء منحنى قياسي لإجراء عملية وظيفية للبروتين، استخدم شريحة زجاجية منقوشة بقطب ذهبي وقطب ITO متجاورين ومحتويين ضمن A-P-D-M-S.

يتم تحيز القطب الذهبي بجهد كاثودي لترسيب التيزين كهربائيًا كما تم توضيحه سابقًا. بعد شطف الغشاء، يُضاف محلول من مُحفز ذاتي 2 سينثيز (auto inducer two synthase) المسمى بفلورسنت أزرق والمُدعم بالتيروزيناز. يلي ذلك تحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الغشاء بـ PBS كما سبق، ثم طبق جهداً أنودياً على قطب ITO المغمور في محلول ترسيب الألجينات الذي يحتوي على الخلايا المستقبلة. تابع تنفيذ نفس الخطوات الموضحة في عملية الترسيب المشترك لمجموعات الخلايا في الألجينات لتوليد الإشارة المنقولة إنزيمياً. بعد غسل الأغشية، أضف محلولاً بتركيز 5 µM من SAH و PBS مدعماً بـ 10% من وسط LB وبتركيز 1 mM.

قم بتغطية الأقطاب الكهربائية بكلوريد الكالسيوم لمنع تبخر المحلول، ثم حضّنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. سيسمح ذلك باستجابة خلية المستقبل من خلال توليد بروتين فلوري أحمر DS red، ويمكن تصوير الأقطاب المجاورة باستخدام المجهر الفلوري عن طريق ضبط المرشحات لالتقاط الفلورة الزرقاء لـ inducer two synthase والفلورة الحمراء التي تعبر عنها خلايا المستقبل الموائمة. يمكن للإشارات الكهربائية المفروضة أن تخلق بيئات دقيقة موضعية بالقرب من سطح القطب، ويمكن لهذه المحفزات أن تحفز التجميع الذاتي للسكريات المتعددة مثل alginate و razan لتترسب كغشاء هيدروجيل على سطح القطب.

بما أن تحول الهلام من الحالة السائلة إلى الحالة الصلبة يحدث عند سطح القطب الكهربائي، فإن الغشاء الناتج يتم توجيهه كهربائياً بحيث تتطابق هندسته مع نمط القطب. وباستخدام الألجينات، تم الترسيب المشترك لمجموعات خلوية فريدة في مواقع توجيه منفصلة. ويُلاحظ الدليل على توجيهها نحو القطب عند حدوث تفاعل بين مجموعة الخلايا المرسلة ومجموعة الخلايا المستقبلة.

تنتشر جزيئة المحث الذاتي 2 (auto inducer two) من الخلايا المرسلة وتُمتص بواسطة الخلايا المستقبلة، مما يؤدي إلى تعبير البروتين الفلوري الأحمر DS red. هنا، يُلاحظ الفلورسنت الأحمر فقط عند القطب الكهربائي حيث يتم توجيه المستقبلات. وفي المقابل، يوفر إنزيم الاستشعار الحيوي جلوكوز أوكسيديز (glucose oxidase) القدرة على الكشف عن الجلوكوز من خلال تفاعل إنزيمي عن طريق إنتاج بيروكسيد الهيدروجين، والذي يمكن بعد ذلك أكسدته كهروكيميائياً لإنتاج تيار مخرج.

بهذه الطريقة، يمكن تحويل الإشارة الكيميائية إلى إشارة كهربائية. يوضح هذا المخطط أن الأغشية التي تم فيها ربط Geo X كيميائيًا تنتج إشارة antic قوية في وجود الجلوكوز، على عكس الأغشية التي لا تحتوي على Geo X. تشير هذه النتائج إلى إمكانية تجميع Geo X على غشاء zam المترسب و/أو احتفاظه بالنشاط الحفزي. علاوة على ذلك، يتم إنتاج زيادة تدريجية في تيار otic استجابة لزيادة تركيزات الجلوكوز.

يظهر المنحنى القياسي المعروض أيضاً أن الزيادات التدريجية تمت بطريقة شبه خطية اعتماداً على كمية الجلوكوز المضافة. وتوضح هذه النتائج أن الإنزيم يحتفظ أيضاً بحساسيته عند اقترانه بفيلم Razza كما هو موضح هنا، حيث يتضمن I two synthase علامة Penta tyrosine. يعمل Tyrosinase على علامة tyrosine عن طريق أكسدة مجموعات الفينول في البقايا إلى o quinones، والتي ترتبط بعد ذلك تساهمياً بـ amine الخاص بـ kazan. ويظهر دليل وظيفية فيلم Kazam داخل a i two synthase بواسطة تجميع Tyrosinase في صورة الفلورسنس هذه التي تعرض فيلم kaza على الذهب، حيث تم تمييز I two synthase الوظيفي بصبغة فلورسنت زرقاء؛ وبما أن a I two synthase ينتج a I two من الركيزة SAH بنفس طريقة الخلايا المرسلة، فإن قربه من الخلايا المستقبلة التي تم تطويعها في وجود SAH يؤدي أيضاً إلى استجابة الخلايا المستقبلة فلورسنسياً عن طريق التعبير عن ds.

يُظهر الفلورة الحمراء للخلايا المستقبلة مرة أخرى حدوث تفاعل بين العناوين نتيجة انتشار ai، من أحدها إلى الآخر، ويشير ذلك كذلك إلى أن الإنزيمات العشرة المثبتة على tizen تحتفظ بنشاطها بمجرد ارتباطها تساهمياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الترسيب الكهربائي لأغشية السكريات المتعددة وكيفية وظيفيتها باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. لقد أثبتنا المرونة في خطوات الوظيفية هذه، مما يسمح لنا بالعمل مع مجموعة كبيرة من المكونات البيولوجية في الاختبارات اللاحقة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون بضع دقائق فقط لإنتاج أنماط غشائية محددة بدقة يمكن تطعيم المكونات البيولوجية عليها بدقة. وبهذه الطريقة، نتمكن من إنشاء أسطح نشطة ومنمطة بيولوجياً على أقطاب كهربائية محددة بكل سهولة، ويتم ذلك كله بأسلوب منظم مع القدرة على تحقيق تفاعلات بيولوجية معقدة. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن توظيف الإبداع في كل من تصميم المصفوفة الكهربائية واختيار المكونات البيولوجية لتحقيق التفاعل التصميمي المنشود.

يحدونا الأمل في أن تساهم أدوات التصنيع الحيوي في الجسر بين مجالين متباينين، وهما التكنولوجيا الحيوية والإلكترونيات الدقيقة، واللذين أحدث كل منهما بمفرده ثورة في حياتنا. ومن خلال الربط بين هذين المجالين، نعتقد أننا سنبتكر حلولاً جديدة لبعض أكثر المشكلات إلحاحاً في المجتمع. فعلى سبيل المثال، نتصور أن التصنيع الحيوي قد يوفر طرقاً بسيطة ومتعددة الاستخدامات لأساليب استشعار جديدة، وللرعاية في نقطة تقديم الخدمة، وتشخيص الأمراض، واستشعار التهديدات البيولوجية والكيميائية.

قد يكون أحد الأمثلة بعيدة المدى هو أن الجيل القادم من الدعامات الشريانية سيكون قادراً أيضاً على مراقبة ملفك الأيضي بالإضافة إلى إبقاء الشريان مفتوحاً.