يزدرع الثقافات العصبية من القيطم المورق

الهدف من هذا الإجراء هو زراعة مخاريط نمو Xenopus Lavis لتحليل الصور اللاحق عالي الدقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن إناث الضفادع أولا بالهرمون لتحفيز إنتاج البيض. الخطوة الثانية هي جمع البويضات وتخصيبها ، ثم حقنها ب mRNA أو غيرها من التركيبات ذات الأهمية.

في اليوم التالي ، يتم تشريح الأجنة وعزل الأنابيب العصبية وتقطيعها وطلاءها على زلات الغطاء. الخطوة الأخيرة هي تصوير المحاور المتنامية ومخاريط النمو. في النهاية ، يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري عالي الدقة لإظهار التغييرات في توطين البروتين في مخاريط النمو بمرور الوقت.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم تشريح الأنبوب العصبي من قراءة قسم الطريقة دون مراقبة التقنية بشكل مباشر. الحصول على بويضات من إناث الضفادع التي تم حقنها مسبقا ب 400 وحدة من موجهة الغدد التناسلية المشيمية قبل 12 إلى 14 ساعة. اجمع البيض في محلول رنين معدل بعلامة X.

ثم قم بتخصيب X الذي تم جمعه في المختبر باستخدام خصيتين مفروم كما هو موضح سابقا ، وأضف 0.1 XMMR بعد 20 دقيقة على الأقل. قم بإزالة الوسائط واحتضان الأجنة في 2٪ سيستين في XMMR واحد عند درجة الحموضة 7.8 لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لإزالة طبقة الهلام الجنينية. ثم صب الأجنة في دورق

بعد ذلك ، اغسل الأجنة بمحلول ملحي معدل 0.1 XMMR أو 0.1 × ثلاث إلى خمس مرات بعد الغسيل النهائي. احتفظ بالأجنة في 0.1 XMMR في درجة حرارة الغرفة حتى الحقن أو إذا رغبت في ذلك. ضع الأجنة عند 14 إلى 18 درجة مئوية لإبطاء النمو قبل الحقن.

يخفف الحمض النووي الريبي المغطى المحضر مسبقا إلى تركيز نهائي من 50 إلى 200 بيكوغرام من لتر الموز بالماء المقطر المزدوج ، ثم يخزن على الثلج حتى الحقن الدقيق. بعد ذلك ، قم بإعداد إبرة الحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية بو سيليكات باستخدام مجتذب سوتر أو أداة مماثلة. ثم تحت المجهر ، استخدم الملقط لكسر طرف الإبرة بزاوية لتوليد شكل يشبه الريشة وردم الإبرة ب 0.5 إلى ميكرولتر واحد من محلول الحمض النووي الريبي المخفف.

قم بتركيب الإبرة على المناور الصغير يتم استخدام حاقن PLI 100 PICO للنظام الطبي هنا. الآن ، ضع الأجنة المخصبة في مرحلة الخلية الواحدة إلى أربع خلايا في طبق بلاستيكي يحتوي على 5٪ فول في 0.1 XMMR. قم بمعايرة حجم الحقن لكل ماصة دقيقة جديدة باستخدام ميكرومتر جذري أو مرحلي.

ثم اضبط حاقن بيكو لتوصيل الكمية المطلوبة من الحمض النووي الريبي لكل حقنة. هنا يتم استخدام حجم حقن نانولتر واحد. امسك الأجنة بالملقط أو إذا كنت تفضل وضعها على منصة تثبيت وحقن الحجم المطلوب في مكبرات.

توزيع الحقن في عدة مواقع في جميع أنحاء الجنين للحصول على توزيع موحد للحمض النووي الريبي. يتم إجراء حقنة واحدة أو حقنتين في كل ناسف لجنين من أربع خلايا ، بينما يتم استخدام حقنتين إلى أربع حقن لجنين من مرحلتين من خلية. بعد الحقن ، انقل الأجنة المحقونة إلى طبق بلاستيكي يحتوي على 0.1 XMMR واتركها تتطور حتى المرحلة 20 إلى 23.

اعتمادا على سرعة التطور المطلوبة ، يتم تحضين الأجنة عند درجة حرارة 14 إلى 22 درجة مئوية أطباق الثقافة المعالجة PLL مع 10 ميكروغرام لكل مليلتر من اللامينين في PBS ووضع الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، اغسل الألواح ثلاث مرات مع الحرص على PBS حتى لا يترك السطح المطلي باللاتينية يتعرض للهواء بعد الغسيل النهائي. استبدل PBS بوسائط الثقافة.

أخيرا ، قم بإعداد ثلاثة أطباق مغلفة بالزراعة عن طريق طلاء قاع الطبق المزروع بنسبة 1٪ aros في 0.1 XMMR والسماح له بالتصلب. بمجرد تصلبه ، املأ طبقا واحدا بتباين وسائط شتاينبرغ في التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال المحقون قد يتسبب في ظهور الأجنة فسيفساء من التألق قبل إجراء التشريح. فحص الأجنة بحثا عن وجود التألق وتحديد تلك الأجنة التي تعبر عن بروتين الاندماج الفلوري في الأنبوب العصبي.

ثم انقل الأجنة الفلورية في المرحلة 20 إلى 23 إلى طبق بلاستيكي مغلف بالزراعة يحتوي على وسائط شتاينبرغ. ضع الطبق تحت مجهر تشريح واستخدم ملقطا دقيقا لإزالة غشاء الزجاج. بعد ذلك ، بينما يثبت أحد الملقط الجنين في مكانه ، استخدم الثاني لعمل شق على جانب الجنين وفضح الجزء الداخلي المجوف.

بعد ذلك ، استخدم كلتا المجموعتين من الملقط للضغط على طول الأنسجة بين النصفين الظهري والبطني للجنين لقطع الجنين إلى نصفين وعزل الجزء الظهري الذي يحتوي على الأنبوب العصبي. ضع الظهر X explan في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على ملليغرامين لكل مليلتر ، كولاجيناز في وسائط شتاينبرغ وضعه على دوار لمدة 15 إلى 20 دقيقة. ثم انقل الخطة الظهرية إلى طبق مغلف بالزراعة مليء بوسائط شتاينبرغ الطازجة.

أثناء العمل تحت المجهر ، قم بتشريح الأنبوب العصبي من البشرة الظهرية والنور البطني عن طريق انزلاق طرف الملقط بين البشرة والأنسجة الأساسية ، وسحب البشرة ببطء. ثم استخدم ملقطا واحدا لتثبيت الأنسجة وآخر لإزالة الأنسجة المحيطة بالأنبوب العصبي. بعد ذلك ، انقل الأنبوب العصبي المفصل إلى طبق مغطى بالزراعة مليء بوسائط الاستزراع الطازجة.

بمجرد جمع العديد من الأنابيب العصبية ، تقوم بشحذ إبر التنغستن أو ملقطها لتقطيع كل أنبوب إلى حوالي 20 قطعة. ثم ضعي القطع على أطباق الاستزراع المغلفة باللامينين ، ووزعي الباذنجان بالتساوي في صفوف. بعد طلاء الأنابيب العصبية ، لا ينبغي تحريك الأطباق لأن ذلك سيزعج ارتباط الخلايا.

احتضان الأنبوب العصبي المطلي عند 20 إلى 22 درجة مئوية. حاضنة زراعة الخلايا غير مطلوبة لثقافة الخلايا العصبية XUS lavis بعد 12 إلى 24 ساعة من طلاء الخلايا العصبية للصور ومخاريط النمو في درجة حرارة الغرفة. ضع في اعتبارك أن التعبير المتغير عن الحمض النووي الريبي قد يؤدي إلى مجموعة من مستويات التألق بين مخاريط النمو.

تظهر صورة DIC هذه المحاور العصبية التي تنمو خارج X explan في الزاوية العلوية اليسرى من مجال الرؤية. يمثل شريط المقياس في هذه الصورة والصور التالية 10 ميكرون. يظهر فيلم التكبير العالي هذا مخروط النمو عند طرف محور عصبي متنامي.

أخيرا ، يظهر فيلم الفحص المجهري الفلوري هذا تعبيرا عن EB واحد GFP في مخروط النمو. أثناء وجودنا هنا ، نقدم مثالا على التصوير ، بروتين الانصهار الزائد EB واحد GFP. يمكن تطبيق طريقة الزرع العصبي هذه على أي عدد من البروتينات لتوضيح سلوكياتها داخل مخروط النمو أثناء نمو العصب.