غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة تكوين بوليمرات الجدار الخلوي عبر مجموعة واسعة من النباتات أو أنواع الأنسجة باستخدام مصفوفات الغليكان الدقيقة. أولاً، يتم حصاد الأنسجة النباتية المطلوبة، ثم تُحضّر الرواسب غير القابلة للذوبان في الكحول بعد عملية التجانس.

بعد ذلك، استخلص غليكانات الجدار الخلوي بالتتابع باستخدام CDTA وهيدروكسيد الصوديوم. ثم قم بطباعة مستخلصات غليكان الجدار الخلوي في مصفوفة مجهرية (microarray) باستخدام روبوت. اختبر المصفوفات المجهرية باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة موجهة ضد غليكانات الجدار الخلوي، وقم بقياس إشارات البقع على المصفوفات المجهرية.

في النهاية، يمكن استخدام النتائج لتحديد الوفرة النسبية لـ glycan epitopes عبر مجموعة العينات المستهدفة. لقد طورنا طريقة المصفوفة الدقيقة هذه عندما أدركنا الحاجة إلى تقديم صورة شاملة لمدى تواجد الجليكانات في الجدار الخلوي عبر أنواع متعددة من الأنسجة النباتية في وقت واحد والكشف عن الاختلافات في التركيب. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق التقليدية، مثل تحليل السكريات الأحادية، هي أنها منصة تعتمد على المصفوفات الدقيقة حيث يمكن فحص مئات العينات في آن واحد. وتعد هذه طريقة سريعة وشاملة لتوصيف تركيب الجدار الخلوي. لكل نسيج مستهدف، ابدأ بعينات مكررة ثلاث مرات بوزن 100 milligrams من الوزن الطازج للأنسجة النباتية باستخدام النيتروجين السائل.

قم بتجنيس العينات حتى تتحول إلى مسحوق ناعم، ثم انقل المادة المتجانسة إلى أنابيب بلاستيكية مخروطية سعة 10 milliliter لتحضير مادة جدار الخلية. أعد تعليق المادة المتجانسة في 10 milliliters من ethanol بتركيز 80% في درجة حرارة الغرفة، واستخدم جهاز المرج (vortex) بقوة لمدة دقيقتين. قم بطرد العينات مركزياً عند 3, 500 ×g وتخلص من الراشح.

كرر عمليات الغسل بـ 70% ethanol ثلاث مرات على الأقل أو حتى يصبح الطافي رائقاً. ثم قم بإجراء غسلة نهائية بـ 100% acetone. افرد الرواسب غير القابلة للذوبان في الكحول واتركها تجف في الهواء طوال الليل للحصول على مسحوق ناعم ومتجانس، ثم قم بنخل عينات الرواسب غير القابلة للذوبان في الكحول باستخدام منخل بفتحات قياسها 0.4 millimeter squared.

بعد ذلك، قم بوزن 10 milligrams من عينات الرواسب غير القابلة للذوبان في الكحول في أنابيب دقيقة تحتوي كل منها على خرزة زجاجية بحجم ثلاثة millimeter للمساعدة في الخلط. ولاستخلاص البكتينات والبوليمرات المرتبطة بها، أضف 500 µL من CDTA بتركيز 50 millimolar إلى كل عينة، وقم برج الأنابيب لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex، ثم اخلطها باستخدام جهاز tissue izer لمدة ثلاث ساعات بتردد ثمانية hertz. قم بإجراء عملية الطرد المركزي للعينات عند 12,000 ×g.

ز. أزل السوائل الطافية بعناية واحفظها عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الرواسب مرتين باستخدام 1 mL من الماء منزوع الأيونات. أزل جميع السوائل من الأنابيب المتبقية من رواسب جدار الخلية.

باشر باستخلاص الغليكانات المترابطة باستخدام 500 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 4 M مع 0.1% هيدريد الصوديوم. وباستخدام عملية الاستخلاص الموصوفة سابقاً، قم بتخزين السوائل الطافية التي تحتوي على الغليكانات المترابطة عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الراسب مرتين بالماء منزوع الأيونات.

ثم باستخدام 500 µL من مستخلص Cain، يتم استخلاص البوليمرات المتبقية مثل السليلوز عبر الطرد المركزي، مع جمع السوائل الطافية التي تحتوي على بوليمرات جدار الخلية المستخلصة لإزالة أي مواد جسيمية. بعد ذلك، يتم تحميل 50 µL من كل عينة في لوحة معايرة دقيقة من البولي بروبيلين تحتوي على 384 بئراً، وذلك باستخدام مخطط مخصص ومصمم مسبقاً حيث تُرتب العينات وفقاً لنوع النسيج ونوع الاستخلاص.

بعد ذلك، يتم تخفيف عينات بوليمر جدار الخلية باستخدام الماء منزوع الأيونات لتحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار صفر و5 و25 ضعفاً. يتم ضبط المعاملات مثل ارتفاع المسمار، والجمع، ووقت المكوث، وخطوات الغسل الخاصة بالمصفوفة الدقيقة. يتم التحكم في رطوبة غرفة الطباعة عند 60% لمنع تبخر العينة.

ابدأ الآن عملية الطباعة. يستخدم الروبوت دبابيس ذات قنوات شعيرية لطباعة المحاليل من لوحة العينات على غشاء نيتروسليلوز مثبت على لوحة مسطحة داخل الجهاز. تحتوي كل بقعة في المصفوفة على 15 nanoliters من المحلول، وتُطبع في ثلاث نسخ مكررة.

قم بطباعة مصفوفات ميكرونية متطابقة بجانب بعضها البعض على الغشاء ثم قصها إلى مصفوفات فردية. وللحد من الارتباط غير النوعي، قم بحجب كل مصفوفة ميكرونية في محلول مسحوق حليب خالي الدسم بنسبة 5% في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

أضف الأجسام المضادة أحادية النسيلة النوعية لغليكان جدار الخلية والمحددات المستضدية، وحضنها لمدة ساعتين. ولإزالة الارتباط غير النوعي، اغسل المصفوفات الدقيقة ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بمسح المصفوفات الدقيقة باستخدام جسم مضاد ثانوي مقترن ببيروكسيداز الفجل لمدة ساعتين بعد إجراء ثلاث غسلات بـ PBS لمدة خمس دقائق لكل منها.

قم بتحميض المصفوفات الدقيقة باستخدام ركائز مولدة للألوان أو ركائز ذات تألق كيميائي. امسح المصفوفات الدقيقة فردياً باستخدام ماسح ضوئي مكتبي عالي الدقة. احفظ الصور كملفات TIFF سلبية بنظام 16 بت.

احسب الكثافة التكاملية لكل بقعة باستخدام برنامج معالجة الصور explore المزود بأداة شبكة مؤتمتة. ثم قم بتصدير بيانات الشبكة لكل مصفوفة مجهرية كملف نصي. استورد ملف البيانات يدويًا إلى جدول بيانات Excel لإجراء التحليل.

احسب متوسط شدة البقعة التكاملية عبر مكررات الطباعة والتخفيفات للحصول على قيمة متوسط شدة البقعة لكل عينة. قم برسم متوسطات شدة البقع النسبية بين العينات المختلفة على شكل خريطة حرارية باستخدام التنسيق الشرطي في برنامج Excel أو عبر برنامج رسم الخرائط الحرارية المتاح على الإنترنت. استخدم الأدوات المخصصة لإزالة إشارة الخلفية والنتائج الإيجابية الكاذبة لكل نوع من الأجسام المضادة، وقم بتصحيح البيانات إلى 100، وفرض قيمة قطع بنسبة 5%.

استُخدم تحليل شامل لملفات البوليمرات بواسطة المصفوفات الدقيقة لقياس الوفرة النسبية للجليكانات في ستة أنواع من الأنسجة، وهي خيوط المتك، وحبوب اللقاح، والمبايض، والبتلات، والأسدية، والميسم من نبات nicotiana. وبالنسبة لجميع هذه الأزهار، تم فحص المصفوفة الدقيقة باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة JIM 5، وهو جسم مضاد متخصص في إبيتوپ محدد على السكريات المتعددة البكتينية. يُلاحظ أن إبيتوپ JIM 5 يتم اكتشافه في مستخلصات CDTA لجميع أنسجة الأزهار.

ومع ذلك، فإن تركيزه يكون الأعلى في حبوب اللقاح والأدنى في أنسجة الميسم. ومن المثير للاهتمام أن الحاتمة JIM five تُكتشف أيضاً في مستخلصات هيدروكسيد الصوديوم لحبوب اللقاح، ولكن ليس في الأنسجة الأخرى. ويتم الحصول على المعلومات الكمية عن طريق إنشاء منحنيات قياسية لمختلف السكريات المتعددة المنقاة التي عولجت كمعايير داخلية على المصفوفة الدقيقة في أنسجة المبيض.

كان هناك ما يقرب من 157 ميكروغرام من hoog الذي يحتوي على الحاتمة JIM five في كل عينة، وهو ما يمثل حوالي 1.5% من إجمالي بقايا الجدار الخلوي، بينما وجد 625 ميكروغرام من hoog Ronin الذي يحتوي على الحاتمة JIM five في أنسجة حبوب اللقاح، وهو ما يمثل حوالي 6.25% من إجمالي بقايا الجدار الخلوي. تم تلخيص الوفرة النسبية لـ 15 حاتمة غليكان عبر جميع أنواع الأنسجة في شكل خريطة حرارية. وتتناسب شدة أشرطة الألوان مع متوسط شدة البقع المعدلة لكل عينة.

يتيح التمثيل التصويري لهذه البيانات تفسيراً سريعاً للاختلافات في حدوث مستضدات الجليكان بين أنسجة الزهرة المختلفة. وتشير هذه النتائج إلى أن مستضدات الجليكان الفردية موزعة بشكل فريد بين أنواع الزهور المختلفة. على سبيل المثال، يُعد مستضد LM 13 الأكثر وفرة في خيوط الأسدية وأنسجة SE L مقارنة بالأنسجة الأخرى.

يتناقض هذا النمط بشكل صارخ مع نمط الحواتم ذات السلاسل الأقصر التي يتم الكشف عنها بشكل تفضيلي بواسطة MAB LM six. كما تمتلك الغليكانات ذات الروابط المتقاطعة أنماط ظهور متميزة في العديد من الأزهار؛ فعلى سبيل المثال، يتوفر الحاتمة LM 10 بكثرة في نسيج الميسم مقارنة بالأنسجة الأخرى، ولكنه يغيب عن نسيج المبيض.

تكون حتات الجليكان LM 15 xog في أعلى مستوياتها في البتلة وخيط المتك مقارنة بالأنسجة الأخرى، بينما تكون hetero manin في أعلى مستوياتها في خيوط المتك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص وتحديد الوفرة النسبية لجليكانات الجدار الخلوي عبر مجموعة واسعة من النباتات وأنواع الأنسجة. وبمجرد إتقان استخدام المصفوفات الدقيقة، يمكن إتمام هذه التقنية في ثلاثة أيام.

من المهم تذكر معاملة العينات والمكررات بشكل متسق في كل خطوة تتبع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسات حمض النيتريك والخل للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال، ما هو المحتوى المطلق للسليلوز المتبقي بعد الاستخلاص المتسلسل للبكتينات والغليكانات المتصلة باستخدام CDTA وهيدروكسيد الصوديوم؟

تتمتع هذه التقنية بقابلية تطبيق واسعة في مجال بيولوجيا الخلية النباتية للمقارنة السريعة لوجود الغليكان في النباتات النموذجية مثل Arabidopsis وFisca وNutella، بالإضافة إلى نباتات أخرى مثل القطن والقمح والأوكالبتوس والتبغ.