Chemoselective تعديل السطوح الفيروسية عن طريق الكيمياء نقرة Bioorthogonal

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح طريقة مرنة لإعادة هندسة الأسطح الفيروسية عبر كيمياء النقر. في الخطوة الأولى من هذا الإجراء، يتم إصابة خلايا الكلى الجنينية البشرية بالفيروس الغدي من النوع الخامس وتحضينها في وجود إما الحمض الأميني غير الطبيعي homo alanine أو سكر الأسيتو N acetoacetyl glucosamine. وبعد يومين، يتم حصاد جسيمات الفيروس الغدي الموصومة بالأزيد وتنقيتها.

بعد ذلك، يتم استخدام تفاعل الإضافة الحلقية للأزيد والألكاين النوعي كيميائياً لربط المسابير الفلورية بسطح هذه الجسيمات. وكما هو موضح في البروتوكول المكتوب، يتم تنفيذ ذلك باستخدام إحدى طريقتين ممكنتين للربط: إما عن طريق تحفيز التوتر أو عن طريق تحفيز النحاس.

في التطبيقات العلاجية، يمكن أن تشمل هذه الملحقات بوليمرات بولي ببتيد أو جزيئات صغيرة. في هذه التجربة، يُستخدم مسبار فلوري بحيث يمكن إثبات ربط المسبار ببروتينات القفيصة عبر تحليل SDS page. هناك اهتمام كبير بتطوير الفيروسات كعوامل لإيصال الجينات، لا سيما في سياق العلاجات، وإيصال الجينات، والعلاج الورمي، وتكنولوجيا اللقاحات.

في هذا السياق، يعد ضبط الواجهة بين الفيروس والعائل أمرًا بالغ الأهمية من حيث الحصول على الخصائص المناسبة لهذا الاستهداف النسيجي العلاجي لتحفيز المناعة. وهناك عدد من العوامل الأخرى المهمة فيما يتعلق بضبط الواجهة بين العائل والفيروس. وفي هذا الإطار، قمنا بتطوير بروتوكول وسم يتكون من خطوتين.

تتمثل الخطوة الأولى في الإدخال الأيضي لحمض أميني غير طبيعي أو سكر غير طبيعي. يؤدي ذلك إلى تثبيت نقطة تثبيت يمكننا بعد ذلك تطويرها باستخدام كيمياء ذات انتقائية عالية جداً، مما يسمح لنا بإلحاق أي وظيفة نرغب بها بتلك الفيروسات دون التأثير بشكل كبير على قدرة الفيروس على العدوى أو لياقته العامة، وهو ما يمثل عائقاً رئيسياً يجب تجاوزه. بعد تعقيم غطاء التدفق الصفحي ومعدات المختبر، يتم تحضير 11 طبق استنبات بقطر 100 millimeter من خلايا HEK 2 93 المحفوظة في وسط نمو HEK عند 37 degrees Celsius.

بعد أن تصل كثافة المزرعة الخلوية إلى 80 إلى 90% من التلاقي، قم بإزالة وسط النمو من أحد الأطباق واغسله مرة واحدة باستخدام منظم TD. قم بفك الخلايا بإضافة 1 mL من trypsin EDTA وحضنها لمدة دقيقة واحدة. أضف 9 mL من وسط النمو وقم بعدد الخلايا التي تم حصادها في هذا الطبق.

باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer)، احسب عدد جزيئات الفيروس الغدّي (adenovirus) المطلوبة للعدوى لكل طبق من أطباق المزرعة العشرة المتبقية. قم بإزالة وسط النمو ببطء، ثم اغسل الأطباق باستخدام 5 mL من منظم TD. أضف 1 mL من منظم العدوى واتركها للحضن لمدة ساعة واحدة خلال هذه الفترة.

قم برجّ الأطباق بلطف من جانب إلى آخر كل 15 دقيقة بعد عملية العدوى. أضف بعناية تسعة مليليترات من وسط نمو HEK إلى كل طبق، ثم قم بالتحضين لمدة 18 ساعة أخرى. من المحاليل المخزنة المركزة لـ HA في Sistine.

قم بتحضير وسط وسم HA وفقاً للبروتوكول المكتوب. تأكد أولاً من ترشيح هذه المحاليل المخزنة باستخدام مرشح حقنة بمقاس 0.2 micrometer. قم بتعقيم المحلول المخزن من الميثيونين الخاص بالمجموعة الضابطة بنفس الطريقة، ثم قم بإزالة وسط النمو بعناية واغسل كل طبق زراعة باستخدام 5 milliliters من TD buffer.

استبدل هذا بـ 10 milliliters من وسط وسم HA واحضن الخلايا المصابة لمدة ست ساعات أخرى. سيتم الآن ترجمة بروتينات القفيصة الفيروسية في وجود azo homo alanine وغياب methionine. استبدل وسط الوسم بعناية بـ 10 milliliters من وسط نمو جديد، ثم احضنها لمدة 18 ساعة أخرى.

بعد الانتهاء من هذه الخطوة، انتقل إلى إجراء التنقية في الخطوة الثالثة من الفيديو. بدلاً من ذلك، يمكن إدخال علامات azi عبر سكريات تحتوي على azi بدلاً من الحمض الأميني غير الطبيعي a HA. في هذا البروتوكول، يتم استخدام n acetoacetyl galacto، وهو طليعة أيضية للطفيليات لـ UDPN Acetoacetyl. Glucosamine، حيث يتم الإنماء في وجود سكر aceto هذا.

سيظهر الفيروس الغدي من النوع الخامس مجموعات azi على الليف فقط لإجراء وسم السكر. أولاً، اتبع الخطوة الأولى من الفيديو حتى يظهر التوجيه على الشاشة. وهذا يقابل الخطوة 1.5 في البروتوكول المكتوب.

قم بتحضير محلول وسم السكر عن طريق سحب 100 µL من المحلول المخزون لسكر ATO باستخدام الماصة ووضعه في أنابيب Falcon، مع ترك الميثانول يتبخر. بعد ذلك، أضف 100 mL من وسط نمو خلايا HEK. قم بتغطية الخلايا في كل طبق بـ 10 mL من وسط وسم السكر هذا، ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 44 ساعة.

انتقل إلى الخطوة الثالثة لإجراء عملية التنقية. انقل الوسط مع الخلايا المصابة من طبق الزرع إلى أنبوبين مخروطيين، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 2000 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق كل راسب في 4 mL من منظم TD باستخدام النيتروجين السائل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C. قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد والإذابة لتحليل الخلايا المصابة. اخلط المعلق باستخدام جهاز المرج (vortex) بين كل دورة وأخرى.

قم بطرد معلق الإذابة مركزياً عند 2000 G لمدة 10 دقائق لترسيب حطام الخلايا؛ وبما أن الفيروس الغدي المستخدم للعدوى في الخطوة الأولى يحتوي على ترانس جين GFP، فإن النشاط الفلوري في هذه الخطوة يؤكد حدوث التنصيب والتعبير عن الحمض النووي الفيروسي. قم بتحضير تدرج كثافة كلوريد السيزيوم بعناية من 1.25 grams per milliliter إلى 1.4 grams per milliliter. انقل الطافي من الخلايا المتحللة باستخدام الماصة فوق تدرج الكثافة، ثم قم بالطرد المركزي عند 126,000 G لمدة ساعة واحدة عند 15 degrees Celsius.

بعد عملية الطرد المركزي، يجب أن تظهر حزمة عريضة وكثيفة في أنبوب الطرد المركزي؛ وهذا يمثل الفيروس المعدل بـ azi. باستخدام إبرة star L، قم بثقب قاع الأنبوب بحيث يقطر المحتوى تدريجياً، ثم اجمع هذا الفيروس بعناية.

أظهر النطاق طريقتي الربط الموضحتين للإجهاد. يتضمن المسار المحفز ظروف تفاعل أبسط، ولكن يعيبه وجود خيارات محدودة من المجسات المتاحة تجارياً لإجراء الربط المحفز بالإجهاد. اخلط 50 µL من الفيروس المعدل بـ azi في محلول تخزين الفيروس مع 0.25 µL من محلول وسم Tamara BCN عن طريق النقر على قاع الأنبوب المغطى بورق القصدير، ثم قم بالتدوير طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

قم بتنقية فيروس الـ click باستخدام الترشيح الهلامي المركزي. قم بموازنة أعمدة الطرد المركزي باستخدام محلول تخزين الفيروس. تتميز عملية الإضافة الحلقية المحفزة بالنحاس (I) الخالية من الأكسجين بتوفر أكبر للمجسات، ولكن يعيبها الحاجة إلى معدات متخصصة للحفاظ على بيئة خالية من الأكسجين.

لإجراء الربط المحفز بالنحاس، يجب أولاً إزالة الأكسجين من جميع مواد ومحاليل التفاعل في كيس قفازات مملوء بالنيتروجين لمدة ست ساعات. بعد هذه الفترة، يتم تحضير المحلول المخزون للمحفز نحاس (I) داخل كيس القفازات لبدء التفاعل. أضف 1 µL من هذا المحلول المخزون للنحاس إلى 50 µL من محلول مسبار الفيروس وعامل مخلبي.

اترك تفاعل الوسم يستمر طوال الليل داخل حقيبة القفازات. قم بتنقية الرشيح كما في الخطوة الرابعة. بعد الغليان، يتم تنقية الفيروس الذي خضع لتفاعل النقر (clicked virus) وعازل عينة التحلل لمدة 10 دقائق.

قم بتعبئة الآبار بالفيروس المختار والضوابط، ثم ابدأ عملية الرحلان الكهربائي. حافظ على تغطية الحوض بورق الألمنيوم لحماية المسبار الفلوري من الضوء. وبعد مرور ساعة واحدة، استخدم ماسحًا ضوئيًا فلوريًا للهلام لمسح الهلام.

لاحظ أن الفيروسات السليمة أو غير المسمى بـ I لا ينبغي أن تحل محل وسم فلوري ملحوظ لـ HA؛ حيث تظهر الفيروسات المنتجة بتركيز أعلى من HA وسماً فلورياً أكبر نظراً لزيادة درجة دمج HA. لاحظ أيضاً أن الفيروس المسمى بالسكر يعبر عن وسوم azi فقط في بروتين الكابسيد الليفي. بدءاً من وصول الخلايا إلى 80%Confluence، يتم تخصيص يومين للعدوى في وسم azi، وخمس ساعات لحصاد وتنقية الفيروس المسمى، وليلة واحدة لتفاعل click، وساعتين لتحليل SDS page، ليصبح المجموع ثلاثة أيام ونصف. وباختصار، تم استعراض نوعين من طرق وسم azi وتفاعلين من كيمياء click للـ azid alkin.

يجب أن يحدد تطبيقك والموارد المتاحة لديك الطريقة أو الطرق الأكثر ملاءمة لغرضك. وعلى الرغم من أن جميع المواد الواردة في هذا البروتوكول متوفرة تجارياً، فقد وجدنا أن تخليق سكريات HA aceto ومجسات INE يعد أكثر فعالية من حيث التكلفة بشكل ملحوظ، ويوفر مرونة أكبر في تعديلات سطح الفيروس.