عالية الإنتاجية ELISA متسلسل للتأكد من صحة العلامات الحيوية من الأمراض الطعم ضد المضيف الحاد

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام إليزا المتسلسلة عالية الإنتاجية من أجل تحليل أعداد كبيرة من المؤشرات الحيوية الجديدة التي اكتشفتها البروتينات بكفاءة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة عينات أولا إلى لوحة المصدر ، والتي تستخدم لإنشاء تخفيف لكل علامة حيوية ولتخزين البلازما المستردة بين الاختبارات. بعد ذلك ، يتم تشغيل Eliza لكل بروتين من أجل تحديد تركيزاته في عينات المرضى.

في النهاية ، يمكن تقييم ارتفاع مستويات البروتين لهذه المؤشرات الحيوية في بداية المظاهر السريرية للطعم الحاد مقابل مرض المضيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن أجهزة التحليل المتسلسلة يمكنها تحليل العديد من البروتينات الجديدة غير المتوفرة دائما مع منصات تعدد الإرسال. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص الكسب غير المشروع الحاد مقابل مرض المضيف.

نظرا لأن المؤشرات الحيوية التي تم التحقق من صحتها من خلال هذه الطريقة يتم الآن التحقيق فيها للرعاية السريرية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للمضاعفات في زرع الخلايا الجذعية الشعرية بعد الصدمة. يمكن أيضا تطبيقه على اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق من صحتها لأمراض أخرى مثل زرع الرئة أو المضاعفات أو سرطان الرئة أو أي مرض يكون اختبار الدم التشخيصي مفيدا له.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث من المهم أن تتم الخطوات المتعددة باستمرار لضمان قابلية التكاثر وتباين الدفعات المنخفض في اليوم السابق للتجربة ، قم بتدوير عينات البلازما الفكرية لمدة 10 دقائق عند 15 ، 300 RCF وأربع درجات مئوية لفصل الجلطات في الأسفل والدهون في الأعلى عن البلازما. ثم قم بوضع 150 ميكرولترا من البلازما غير المخففة من كل عينة على صفيحة سفلية 96 بئر V عن طريق سحب العينة يدويا وفقا لخرائط محددة مسبقا. لف الطبق في Paraform وضعه في غرفة بشرية عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.

بعد ذلك ، بعد إعادة تشكيل وتخفيف IL اثنين من مستقبلات ألفا وعامل النمو البشري ، أو الأجسام المضادة لالتقاط HGF وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ، لوحة 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد في كل بئر من 96 لوحة نصف بئر عالية الارتباط. ثم أغلق هذه الألواح بمادة مانعة للتسرب واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. الآن قم بتخفيف reg three alpha باستخدام عازلة طلاء الشركة المصنعة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ولوحة 25 ميكرولتر من المحلول في كل بئر من 3 84 بئر بدون لوحة maxor.

ثم قم بتخزين هذه اللوحة محكمة الغلق عند أربع درجات مئوية أيضا في اليوم الأول من التجربة. ابدأ بغسل لوحة اختبار ألفا لمستقبلات IL ثنائية ومنعها بوصخة في TBS. بعد إعادة تشكيل المعيار ، قم بإعداد منحنى قياسي من ثماني نقاط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

اللوحة التالية ، 50 ميكرولترا من البلازما غير المخففة و 50 ميكرولترا من كل معيار في نسختين من لوحة المصدر إلى لوحة اختبار ELIZA. ثم احتضان اللوحة المختومة في درجة حرارة الغرفة على دوار لوحة مضبوطة على 300 دورة في الدقيقة. بعد ساعتين ، استرجع البلازما من لوحة اختبار IL ثنائية المستقبل ألفا ELIZA وضعها مرة أخرى في لوحة مصدر البلازما غير المخففة.

ثم بعد الانتهاء من تقييم الأثر البيئي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، اقرأ الكثافة البصرية لكل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 إلى 570 نانومتر لثلاثة ألفا إليزا الغنية أولا 10 ميكرولترات من البلازما غير المخففة إلى لوحة مصدر منفصلة للعرض السفلي ، ثم أضف 90 ميكرولترا من الشركة المصنعة المخزن المؤقت للتخفيف المقدم لكل بئر لإنشاء لوحة مصدر تخفيف من واحد إلى 10. بعد الانتهاء من Reg three alpha Eliza ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، أضف حل التوقف إلى لوحة البئر 384 واقرأ الكثافة البصرية لكل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 إلى 620 نانومتر. بعد إعادة تشكيل وتخفيف و tn FFR واحد التقاط الأجسام المضادة لكل الشركة المصنعة مواصفات رمز كل بئر من 96 بئر عالية ربط نصف بئر لوحات مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة القبضة.

ثم احتضان لوحات الاختبار المختومة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة للوحة وعند أربع درجات مئوية للوحة TN FFR واحدة. بعد الانتهاء من مستقبلات IL ثنائية ألفا إليزا تنقل 60 ميكرولترا من البلازما غير المخففة إلى لوحة مصدر جديدة. ثم عند 60 ميكرولتر من 1٪ BSA في PBS لكل بئر لعمل لوحة مصدر بلازما مخففة من واحد إلى اثنين

بعد ذلك ، اغسل لوحة اختبار HGF وقم بسدها باستخدام BLOTTO في TBS ثم قم بإعداد تخفيف المنحنى القياسي ثماني النقاط. بعد غسل اللوحة ، باتباع لوحة خطوة الحظر 50 ميكرولتر ، قم بتكرار حصص من واحد إلى اثنين من البلازما المخففة وكل معيار على لوحة اختبار EISA. ثم احتضان اللوحة المختومة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على لوحة دوار ضبط 300 دورة في الدقيقة.

في صباح اليوم التالي ، استرجع البلازما المخففة من واحد إلى اثنين من لوحة اختبار HGF Eliza وضعها مرة أخرى في لوحة مصدر البلازما المخففة من واحد إلى اثنين من البلازما المخففة. بعد الانتهاء من تقييم الأثر البيئي ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، اقرأ الكثافة البصرية لكل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 إلى 570 نانومتر في اليوم الثاني من التجربة. قم أولا بنقل 10 ميكرولتر من البلازما غير المخففة إلى لوحة مصدر جديدة ، ثم 190 ميكرولترا من 1٪ BSA في PBS لصنع 200 ميكرولتر من واحد إلى 20 بلازما مخففة.

ثم بعد الانتهاء من ، قرأت إليزا ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، الكثافة البصرية باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 إلى 570 نانومتر. بالنسبة ل TN FFR ، تضيف إليزا أولا 25 ميكرولترا من 1٪ BSA و PBS إلى لوحة المصدر من واحد إلى 20 مما ينتج عنه 125 ميكرولترا من واحد إلى 25 بلازما مخففة لكل بئر. ثم بعد الانتهاء من TN FFR واحد EIA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، اقرأ الكثافة البصرية لكل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 إلى 570 نانومتر للنقل الأول I-L-H-E-I-A ، 60 ميكرولترا من واحد إلى اثنين من البلازما المخففة إلى لوحة مصدر جديدة ، ثم أضف 180 ميكرولترا من IL ثمانية مخفف إلى كل بئر لعمل لوحة مصدر بلازما مخففة من واحد إلى ستة

ثم بعد الانتهاء من ILH Eliza وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، اقرأ الكثافة البصرية لكل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 إلى 570 نانومتر. أخيرا ، بمجرد اكتمال كل Eliza ، استبدل بلازما الحديث غير المستخدمة في Eloqua الفكرية وقم بتجميدها لاستخدامها في المستقبل. في هذا الرسم البياني ، تظهر الكثافة البصرية للمنحنى القياسي لسبع لوحات ELIZA مختلفة تقيس تركيزات ألفا الثلاثة المقابلة ل 1084 مريضا تم اختبارهم للتقرير الأولي للطعم المعدي المعوي ألفا مقابل تقرير المؤشرات الحيوية للمرض المضيف ، وتضمن الكثافة البصرية المتسقة بين اللوحات قياسات تركيز البروتين المتسقة بين التجارب.

تم حساب تركيزات البروتينات في عينات البلازما من خلال مقارنة الكثافة البصرية للعينة بالكثافة البصرية للمنحنى القياسية. يمكن استخدام منصة مناولة نظيفة آليا لزيادة قابلية التكاثر مع تقليل حجم البلازما المستخدمة في تشغيل Eliza وألواح الآبار الإبداعية. أثناء التخطيط لهذا الإجراء ، من المهم تشغيل EISs التي هي بلازما غير مخففة أولا بحيث يمكن استعادتها واستخدامها في تجارب لاحقة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم البروتينات لاستكشاف المؤشرات الحيوية المرشحة في أي مرض ذي أهمية من خلال الاستخدام الشامل لإليزا المتسلسلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقق من صحة المؤشرات الحيوية المتعددة باستخدام E المتسلسل أثناء استخدام كميات صغيرة من البلازما وتقليل الدورات الحرة.