Name: تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: اكتشف طريقة تتبع الفيروسية للدوائر العصبية باستخدام مستقبل TVA في الجهاز العصبي المركزي. هذه التقنية تتيح تحليلاً عالي الإنتاجية للاتصالات العصبية وتوفر فهماً أعمق للشبكات العصبية المعقدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نعترف شون ويلان للحصول على مساعدة إنقاذ المتغيرات VSV المؤتلف، وديدم بيدا وChrenek ريان للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل HHMI (CLC)، و# NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

باستخدام الفيروسات لدراسة الدوائر العصبية هي طريقة إنتاجية عالية نسبيا من الخلايا العصبية تحليل المتصلة. ومع ذلك، على حد سواء توليد VSV وvirions RABV ليست تافهة. على الرغم من أن يتم توفير بروتوكول المذكورة أعلاه لإنقاذ الفيروس من [كدنا]، فإنه لا يزال حدثا المنخفضة الاحتمال. مستويات كل من N، P، والبلازميدات L تحتاج إلى تعديل ناعما، والعديد من التجارب ويعيد تحتاج إلى القيام به لضمان انقاذ الفيروسية. تشكيل الجسيمات ريبونوكليوتيد دمج كامل الجينوم VSV RNA هو حدث احتمال منخفضة، وبالتالي...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;زراعة الأنسجة&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>خلايا كلى هامستر صغيرة (BSRT7)</td><td>متوفرة عند الطلب</td><td></td><td></td></tr><tr><td>فيروس الجدري (vTF7-3)</td><td>متوفر عند الطلب</td><td></td><td></td></tr><tr><td>بلازميدات pN وpP وpl</td><td>متوفرة عند الطلب</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>خلايا HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>طبق زراعة معالج بـ TC بحجم 60 مم</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>دورق زراعة خلايا مستطيل ذو عنق مائل بحجم 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; مع غطاء تهوية</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>الوسط: DMEM (وسط إيجل المعدل لدولبيكو)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: مصل جنين البقر</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>كاشف ترانسفكشن Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>حقنة: حقنة Luer-Lock بحجم 5 مل</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>مرشحات حقن</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: بولي إيثيلين إيمين خطي عالي الفعالية</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;الطرد المركزي الفيروسي&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>نظام ترشيح مفرغ من الأعلى في أنبوب Corning بحجم 150 مل، بمسام 0.45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب طرد مركزي فائق جدرانها رقيقة، فائقة الوضوح، بحجم 38.5 مل، وأبعاد 25 × 89 مم</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي فائق</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>دوار طرد مركزي فائق SW28</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;الحقن في الفئران&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ماصات شعرية دقيقة</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>جهاز التثبيت التجسيمي (Stereotax)</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>المتحكم الدقيق (Micromanipulator)</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>حاقن Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>متحكم دقيق رباعي القنوات</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>محرك M.TXB مكتبي مع تحكم قرصي C.EMX-1، بجهد 115 فولت</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>قطعة يدوية H.10، سريعة التغيير</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>مثقاب تدريجي، 0.5 مم</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>حامل ميكرو&amp;#8211;إلكترود</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>كيتامين</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>زيلازين</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>بوبرنورفين</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>حقنة 1 مل</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>إبرة حقن قياس 30</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>مرهم واقٍ للعين</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>إيثانول</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>يود</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;أدوات الجراحة والتشريح&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>مقصات</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط قياسية</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط دقيقة</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>مقصات فاناس الزنبركية</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>مقبض المشرط</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>شفرات المشرط</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>خيوط جراحية</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;التشريح والصبغ بالأجسام المضادة&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>مصل حمير</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;الأجسام المضادة&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>أجسام مضادة</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>مضاد-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>مضاد دجاج من الحمير Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>مضاد دجاج من الحمير Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;تثبيت الأنسجة&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>شرائح مجهرية Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>زجاج غطاء 22 × 22، سمك 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>إلاستومر سيليكوني</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>طلاء أظافر شفاف</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>كاشف Prolong Gold المضاد للتلاشي</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

الطرق التقليدية لدراسة الدوائر العصبية هي الإنتاجية منخفضة نسبيا. الفيروسات عبر التشابك، وخاصة داء الكلب الكاذب (PRV) وفيروس داء الكلب (RABV)، وفيروس التهاب الفم الحويصلي مؤخرا (VSV)، لدراسة الدوائر، تزداد شعبية. هذه الأساليب أعلى إنتاجية استخدام الفيروسات التي تنقل بين الخلايا العصبية في الاتجاه إما تقدمي أو رجعي. مؤخرا، تم وضع RABV تعديل لتتبع أحادي المشبك الوراء. (الشكل 1A). في هذه الطريقة، يتم حذف بروتين سكري (G) الجينات من الجينوم الفيروسي، والامدادات فقط في الخلايا العصبية المستهدفة. ويتحقق خصوصية العدوى عن طريق استبدال لG خيالية، ويتألف من مجال خارج الخلية من بروتين سكري ASLV A-والمجال حشوية من RABV-G (A RG /)، لG-RABV العادية 1. هذا G خيالية يصيب الخلايا على وجه التحديد التعبير عن مستقبلات TVA 1. يمكن للترميز الجين TVA كان دelivered بطرق مختلفة 2-8. بعد RABV-G إصابة الخلايا العصبيه TVA، معربا عن، يمكن أن يحيل إلى RABV الخلايا العصبية، وغيرها من توصيل synaptically في اتجاه الوراء حسب طبيعة G الخاصة الذي شارك في تسليمها مع مستقبلات TVA. تصف هذه التقنية عدد كبير نسبيا من المدخلات (5-10٪) 2 الصعود إلى نوع من الخلايا المحددة، وتوفير عينات من كل من المدخلات على نوع الخلية كاتب محدد. ونحن مؤخرا تعديل هذه التقنية لاستخدام VSV باعتباره التتبع عبر التشابك 9. VSV ديها العديد من المزايا، بما في ذلك سرعة التعبير الجيني. نحن هنا التفاصيل جديد الفيروسية نظام تتبع باستخدام VSV مفيدة لسبر الدارات الدقيقة للقرار زيادة. في حين أن الاستراتيجيات التي نشرتها الأصلي يكرشام وآخرون (4) وبيير وآخرون .. 9 وضع العلامات تصريح من أي الخلايا العصبية التي يصاب المشروع على TVA-في البداية، معربا عن خلايا، وهنا تم تصميم VSV أن يحيل فقط إلى TVA-معربا عن الخلايا (1B الشكل). وpseudotyped الفيروس لاول مرة مع RABV-G للسماح إصابة الخلايا العصبية المصب من TVA، معربا عن الخلايا العصبية. بعد اصابة هذه الفئة من السكان الأولى من الخلايا، الذي صدر الفيروس يمكن أن تصيب فقط TVA، معربا عن الخلايا. لأنه يقتصر انتشار عبر التشابك الفيروسية لTVA، معربا عن الخلايا، ووجود عدم وجود اتصال من أنواع الخلايا المحددة يتم استكشافها مع ارتفاع القرار. يظهر مخطط تدفق تجريبية لهذه التجارب في الشكل 2. هنا نعرض نموذج الدائرة، وذلك من الانتقائية الاتجاه في شبكية العين الماوس. ندرس التواصل بين الخلايا عديم الاستطالات النجمي (الحويصلات) إلى خلايا الشبكية العقدة (RGCs).

ووصف طريقة تتبع الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. نستخدم TVA خصوصية خلية المنبع لبحث ما إذا كان السكان الخلية ذات الاهتمام يتلقى مساهمات من أنواع الخلايا متشابك تعريف وراثيا.

تعد الطرق الكلاسيكية لدراسة الدوائر العصبية ذات إنتاجية منخفضة نسبيًا. وتعمل الفيروسات العابرة للمشابك، وخاصة فيروس داء الكلب الكاذب (PRV) وفيروس داء الكلب...

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير تقنية جديدة لتحليل الدوائر الدقيقة في الجهاز العصبي المركزي. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق تحديد مجموعة من العصبونات ليتم إصابتها من خلال التعبير عن مستقبل TVA. وفي خطوة ثانية، يتم حقن الفيروس العابر للمشبكات في الجهاز العصبي المركزي، والذي يقوم بإصابة العصبونات الأولية المختارة.بعد ذلك، سينتقل الفيروس فقط عبر المشابك العصبية إلى العصبونات المتصلة التي تعبر عن مستقبل TVA. ومن أجل فحص ما إذا كانت هذه العصبونات متصلة، تم الحصول على نتائج تظهر إمكانية استخدام هذه التقنية لتحليل الدوائر العصبية الدقيقة بناءً على التحقق من وسم دوائر عصبية دقيقة معروفة الاتصال. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية والمجهرية، في كونها طريقة عالية الإنتاجية لتحليل الدوائر العصبية.لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما قرأنا الدراسة الأولى حول التتبع الفيروسي المقيد أحادي المشبك التي أجراها Wickersham وزملاؤه. وشعرنا أنه يمكن هندسة الفيروسات بشكل أكبر لدراسة العصبونات المتصلة بطرق مبتكرة. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب للحصول على تفاصيل حول استعادة VSV من CD NA باستخدام نظام VACCINIA T seven لتوليد الخلايا لغرض التمرير.أولاً، يتم سحب الوسط من أربعة أطباق مقاس 10 سنتيمتر من خلايا TV eight 800 التي وصلت نسبة تلاحمها إلى 80% والتي تم استزراعها في اليوم السابق، واستبداله بخمسة ملليلتر من وسط DMEM غير المكمل. يتم ترانزفكشن كل طبق بـ 5 ميكروجرام من البلازميد الذي يشفر البروتين السكري المطلوب وفقاً للإجراءات القياسية. بعد حوالي ست ساعات من الترانزفكشن، يُستبدل الوسط بوسط DMEM مكمل بـ 10% FBS، ثم تُحضن الأطباق طوال الليل في حاضنة زراعة أنسجة مضبوطة على 34 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide للسماح بتعبير البروتين السكري وتراكمه على السطح.بعد التحضين، يتم سحب الوسط واستبداله بخمسة ملليلتر من DMEM مضافاً إليه 10%FBS، ثم تُعدى كل لوحة بفيروس VSV الذي يحتوي على البروتين السكري الخيمري MA rabies G بتعدد عدوى يتراوح من 0.01 إلى 0.1، وتُحضن عند 34 درجة مئوية طوال الليل. بعد 24 ساعة، يتم فحص مستويات العدوى في كل لوحة باستخدام المجهر الفلوري. وإذا كانت نسبة الخلايا المصابة تزيد عن 50%، يتم جمع الوسط.استبدل المحلول بخمسة مليلترات 5 mL من الوسط الغذائي الطازج، ثم جمد الوسط الذي تم جمعه عند درجة حرارة -80 °C. كرر إجراء الجمع بعد 24 ساعة من ذلك ولمدة ثلاثة أيام، ليكون إجمالي مدة الجمع أربعة أيام. قم بتجميد كل جزء من الوسط الغذائي المجموع بعد تجميد الجزء الأخير تماماً عند درجة حرارة -80 °C، مع العلم أن جميع أجزاء الوسط الغذائي المجمعة كانت عند درجة حرارة 37 °C؛ في هذه المرحلة، يجب أن يكون هناك 80 mL من الوسط الغذائي المجموع. قم بتمرير الوسط الغذائي المجموع عبر مرشحات بمسامية 0.45 micron على الثلج.بعد ذلك، يتم توزيع 36 milliliters من الفيروس في أنبوب طرد مركزي من نوع Beckman، ويتم تركيز السائل الطافي عن طريق الطرد المركزي الفائق بسرعة 80,000 ×g لمدة 90 minutes عند درجة حرارة 4 °C. تأكد من موازنة الدوار بشكل صحيح، وبعد عملية الطرد المركزي، يتم السكب في وعاء يحتوي على 10% من المبيض واستخدام جهاز شفط لإزالة السائل من جانب الأنبوب. ثم تُرج الأنابيب التي تحتوي على الفيروس بسرعة 120 RPM لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C، ويُعاد تعليق الراسب الفيروسي في أقل حجم ممكن، والذي يكون عادةً حوالي 30 µL.بمجرد إعادة تعليق الفيروس، يتم تحديد عياره عن طريق إصابة لوحة ذات 24 بئراً من خلايا 2 9 3 T بسلسلة تخفيفات عشرية تتراوح من 1 إلى 1 مليون، ثم قياس العيار بعد حوالي يومين من الإصابة. ووفقاً للإجراءات القياسية، يمكن الكشف عن الخلايا المصابة بالفيروس عن طريق الفلورة. ومن المهم استخدام المولتين الصحيح لهذه التجارب.الهدف هو جعل مستقبل TVA يتم التعبير عنه في أنواع الخلايا المراد رسم خرائط لها. ويمكن تحقيق ذلك من خلال التعبير عن مستقبل TVA عن طريق الوسائل الفيروسية أو من خلال أليل معدل وراثياً. تستخدم هذه التجربة فئران ثلاثية التعديل الوراثي تتراوح أعمارها بين ستة إلى 10 أسابيع.سيتم تزاوج الفئران التي تعبر عن أليل TVA مشروط مع فئران تعبر عن أليل chat، Cree. بعد ذلك، يتم تزاوج هذه الفئران مع سلالة تعبر عن أليل TD tomato الفلوري. يعبر الفأر المعدل وراثياً النهائي عن TVA وأليل TD tomato مشروط في جميع الخلايا التي تعبر عن Cree، بما في ذلك خلايا starburst omicron المستهدفة.ويمكن تصور هذا التعبير باستخدام المجهر الفلوري. تحقق من الإحداثيات التجسيمية للمنطقة المستهدفة في أطلس دماغ الفأر، وقم بتجهيز الجهاز التجسيمي عن طريق تشغيل وحدة التحكم في الحاقن الدقيق وتحريك المكبس وحامل القطب الكهربائي إلى موضعهما. بعد ذلك، املأ الإبرة من الخلف بالزيت المعدني لتوفير واجهة مع الفيروس، ثم ضع الإبرة على المكبس مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الإبرة.قم بتبريد الفيروس ووضعه على الثلج. اضبط المحقن الدقيق على وضع السحب، ثم حرك أنبوب الفيروس أسفل الشعيرة الموجودة في المحقن الدقيق. اخفض طرف الشعيرة في الفيروس واسحب الكمية اللازمة من الفيروس لإجراء التجربة.بعد إعطاء جرعة من البوبرينورفين قبل العملية، يتم تخدير الحيوان بشكل مناسب وفقاً للإرشادات المؤسسية. يتم إجراء قرص لإصبع القدم والتأكد من غياب الاستجابة الانعكاسية قبل البدء في الإجراء.ضع الفأر المخدّر على وسادة تدفئة مثبتة على حامل متحرك لتحديد وضعية الفأر. ضع مرهم العين لمنع جفاف القرنية أثناء تخدير الحيوان. الآن، ضع الفأر في جهاز التوجيه المجسم (stereotaxic apparatus) عن طريق إدخال قضبان الأذن برفق في القناة السمعية.تأكد من أن الرأس موازٍ لقاعدة المجهر المجسم ولا يتحرك جانبياً. بعد ذلك، اضبط قضيب العض للمساعدة في تثبيت الرأس. قم بإزالة الفراء من منطقة الشق الجراحي.بعد ذلك، اغسل هذه المنطقة ثلاث مرات باستخدام ethanol، ثم ثلاث مرات باستخدام iodine. وبعد إجراء شق سهمي في الجلد باستخدام مقص للكشف عن الجمجمة، قم بإبعاد الجلد باستخدام خطافات جراحية مصنعة محلياً. ثم قم بتثبيت الشعيرة الدقيقة باستخدام bgma واستخدم الأقراص لتحريك الحاقن الدقيق إلى إحداثيات النواة الجنيبية الوحشية (lateral gent nucleus).بمجرد تحديد موقع النواة الركبية الجانبية (LGN)، قم بحفر ثقب صغير في الجمجمة فوق موقع الحقن. ضع الشعيرة فوق الثقب وأنزلها ببطء إلى موضع يكون ظهرياً مباشرة من سطح الدماغ. يمثل هذا الموضع نقطة الصفر للإحداثيات الظهرية البطنية.يجب أن تكون الشعيرة الدقيقة حادة بما يكفي لاختراق الأم الجافية للفأر. لذا، قم بخفضها ببطء إلى عمق 2.75 millimeters واحقن الكمية المطلوبة من الفيروس بسرعة تبلغ حوالي 100 liters per minute. اترك الإبرة في الدماغ لمدة سبع دقائق تقريبًا للسماح بانتشار الفيروس من موقع الحقن ولمنع الفيروس من الصعود عبر الإبرة.بعد ذلك، ارفع الإبرة ببطء شديد على مدار دقيقتين من موقع الحقن وخارج الدماغ. وأخيراً، قم بخياطة الموقع الجراحي ومراقبة الحيوانات حتى تتماثل للشفاء من التخدير. يتم إعطاء buprenorphine كل 12 ساعة لمدة يومين.بشكل عام، يمكن ملاحظة الانتشار عبر المشابك العصبية لفيروس VSV بعد حوالي 24 ساعة من الحقن. ومع ذلك، فإن فترات الانتظار الأطول ستؤدي إلى انتشار أكبر. بعد قتل الفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون، يتم تشريح العين ووضعها في فورمالدهيد بتركيز 4% وتحضينها لمدة ساعة واحدة، مع التأكد من بقاء العين مغمورة تماماً.بعد ذلك، يتم نقل العين إلى طبق بتري يحتوي على PBS. استخدم ملقطاً من المقاس 55 لإزالة القرنية بسرعة، ثم قم بفك وفصل الشبكية عن الأنسجة الأخرى. يتم بعد ذلك إجراء تحليل العينة الكاملة.قم بقص الشبكية على شريحة زجاجية بحيث تكون مسطحة. ضع فواصل سيليكون حول حواف غطاء الشريحة الزجاجية باستخدام وسط تثبيت ذهبي ممتد، ثم استخدم غطاء شريحة زجاجي صفر السمك لتحليل مقاطع الشبكية. ضع الشبكية في محلول 30% sucrose في PBS حتى تغمر الشبكية بالكامل.بعد ذلك، تُوضع الشبكية في خليط يتكون من نسبة واحد إلى واحد من OCT ومحلول سكروز 30% لمدة ثلاث ساعات. وأخيراً، يتم تجميد الشبكية بالتجميد السريع (flash freeze) وتُحفظ في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يحين وقت التقطيع. تُظهر هذه الصورة تجربة زمنية توضح القدرة العدوائية لـ vsv A/rg في خلايا TVA 800 وخلايا 293T.توضح اللوحات العلوية خلايا TVA 800 بعد ست ساعات ويوم واحد ويومين من العدوى. وتوضح اللوحات السفلية خلايا 2 9 3 T في نفس النقاط الزمنية. ينتشر الفيروس بين الخلايا التي تعبر عن TVA في غضون ساعات، بينما يكون الانتشار في خلايا 2 9 3 T، التي لا تعبر عن مستقبل TVA، أبطأ بكثير على الرغم من حدوثه.يمثل شريط المقياس 100 ميكرون. تُظهر هذه الصورة عدوى نموذجية للخلايا العقدية الشبكية في الفئران التي لا تعبر عن TVA. حُقنت الحيوانات في LGN بفيروس vsv A/RG.تم النوع الكاذب باستخدام R-A-B-V-G وتم حصاد الأنسجة بعد يومين من الحقن. تظهر هنا عدوى قليلة حيث تشير رؤوس السهام الصفراء إلى خلايا العقد الشبكية. وتظهر هذه الصورة عدوى أكثر كثافة.يمكن تحقيق ذلك باستخدام معامل عدوى (TI) أعلى للفيروس وحقن بجودة عالية كما هو موضح هنا. يمكن تحديد أنواع مختلفة من خلايا العقد الشبكية بناءً على المورفولوجيا، بما في ذلك خلايا العقد الشجرية الصغيرة، وخلايا العقد الميلانوبسين من النوع الأول، وخلايا العقد الانتقائية للاتجاه أو DS GCs، وخلايا on off DS GCs. هنا يمثل شريط المقياس 50 microns كما هو موضح في الصور التالية لفأر يعبر عن TVA.يتبع انتقال VSVA/RG من خلايا DS GCs ذات النمط "تشغيل-إيقاف" إلى خلايا Starburst omics النمط المتوقع. تقوم خلايا DS GCs ذات النمط "تشغيل-إيقاف" المحددة برأس سهم أبيض وذات تعبئة خضراء بنقل الفيروس إلى عدة خلايا Starburst omics المحددة برأس سهم أصفر. وكما يظهر هنا، فإن جميع الخلايا الخضراء التي ليست DS GCs تظهر تسمية مشتركة مع مراسل Cree، مما يشير إلى أنها خلايا Starburst omics التي تعبر عن TVA.تشير رؤوس السهام البيضاء ذات التعبئة الخضراء إلى خلايا DS GCs، بينما تشير رؤوس السهام الصفراء إلى خلايا Starburst amacrine، مما يوضح الطبقات المناسبة من الطبقة الضفيرية الداخلية للشبكية أو IPL؛ وتشمل الخلايا التي ينقل إليها الفيروس كلاً من خلايا on و off. Starburst amacrine. تشير الأرقام في هذا الشكل إلى طبقات IPL. وبمجرد إتقان الطريقة، يمكن إجراء التجربة بأكملها في يوم أو يومين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.تعد سرعة VSV إحدى مزاياه الرئيسية بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل التخطيط الدائري القائم على opsin أو القناة الحمراء (channel red)، من أجل التحقق من تتبع الدوائر الفيروسية وتحليل خصائص هذه الروابط المشبكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لمعظم الخطوات المختلفة المتبعة في تتبع الدوائر الفيروسية، بدءاً من تنمية الفيروس وصولاً إلى الحقن في الجسم الحي (in vivo)، ثم تحليل العصبونات الموصومة فلورياً.

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

ونحن نقدم دليلا عمليا لتقديم...

الكشف عن العصبية علم الطوبوغرافيا في حلبة لون موضوع

أصبح التتبع عبر المشبكي &lt; p class = 'jove_content '&gt; أداة قوية لتحليل الواصلات المركزية التي تنظم الأهداف الطرفية من خلال دوائر متعددة المشبك. نقدم هنا بروتوكولا يستغل فيروس داء الكاذب عبر المشبكي لتحديد دائرة الدماغ الوظيفية وتوطينها ، متبوعا بتقنيات تتبع المسالك الكلاسيكية للتحقق من صحة روابط محددة في الدائرة بين مجموعات محددة من الخلايا العصبية.

عبر التشابك تتبع من الأهداف الطرفية مع فيروس داء الكلب الكاذب تلاه سهم الكوليرا السمية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران الأمينات مزدوجة وصفها

بالاستفادة من استراتيجية وراثية ثنائية ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتتبع الدوائر العصبية في الفئران التي تعبر عن متتبعات تكميلية عبر المشبكي بعد إعادة التركيب بوساطة Cre. نظرا لأن إنتاج التتبع الخاص بالخلية مشفر وراثيا ، فإن نهجنا التجريبي مناسب لدراسة تكوين ونضج الدوائر العصبية أثناء نمو الدماغ الجنيني للفئران بدقة خلية واحدة.

شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

هنا نصف إجراء يعتمد على استخدام جزيئات الفيروسات العدسية للتعديل الجيني طويل المدى للخلايا الجذعية العصبية و / أو الخلايا البطانية العصبية المجاورة لها في مكانة عصبية البطين تحت البطين البالغة والتي تسمح بتحليل منفصل للخلايا المستقلة وغير المستقلة والمعتمدة على الخلايا الجذعية العصبية.

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

وصفنا تقنية لتسمية الخلايا العصبية والعمليات الخاصة بها عن طريق تقدمي أو رجعي التتبع الحقن في نوى الدماغ باستخدام إعداد في المختبر. نحن تعديل طريقة القائمة ط ن معمليا التتبع Electroporation للمن خلال الاستفادة من fluorescently المسمى المسوخ الماوس وأجهزة بصرية الأساسية من أجل زيادة دقة وضع العلامات.

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

يصف هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من السكان العصبية انتقائية، وصفت بعد الإصابة الوراء مع فيروس داء الكلب المعدلة ويعبرون عن علامات الفلورسنت، ومستقلة، مجموعة مشاركات التحليلات التي تمكن توصيف شامل من المقاييس المورفولوجية بين الفئات الفرعية العصبية متميزة.

إعادة بناء واسعة النطاق والمستقل، تجميع غير متحيز واستنادا المورفولوجية المقاييس لتصنيف الخلايا العصبية في الانتقائي السكان

استنادا ً إلى الهندسة الفيروسية في المختبر للسلائف العصبية، وزرعها المشترك في العقول البرية والتقييم المورفومتري المقترن لمشتقات "الاختبار" و"التحكم"، تسمح هذه الطريقة بنمذجة دقيقة للتحكم في الجينات الحية للنيوكورتيكال مورفولوجيا الخلايا العصبية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة.

زرع داخل البطين من السلائف العصبية المهندسة لدراسات الهندسة العصبية في الجسم الحي

يهدف هذا البروتوكول إلى توليد الخلايا العصبية البينية المعاد برمجتها مباشرة في الجسم الحي، وذلك باستخدام نظام فيروسي قائم على AAV في الدماغ ومراسل GFP يعمل على إزالة المشبك المرن، والذي يسمح بتحديد الخلايا والمزيد من التحليل في الجسم الحي.

في فيفو إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الغلية المقيمة في الخلايا العصبية المشتركة عن طريق الحقن داخل الدماغ من ناقلات الفيروسية

يوضح البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتتبع إسقاطات الغلوتامات للمنطقة البطنية (VTA) إلى قرن آمون. تم الجمع بين التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA مع تسجيل CA1 لإظهار كيفية محطات الغلوتامات VTA تعدل CA1 معدل إطلاق الهرمي المفترض في الجسم الحي.

مجتمعة في فيفو التشريحية والوظيفية تتبع من محطات الغلوتامات منطقة البطن في قرن آمون

نقدم هنا بروتوكولا يصف النقل الفيروسي لمناطق الدماغ المنفصلة ذات التركيبات البصرية الجينية للسماح بالتوصيف الكهروفسيولوجي الخاص بالمشابك العصبية في شرائح دماغ القوارض الحادة.

السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.

تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية

اكتشف طريقة تتبع الفيروسية للدوائر العصبية باستخدام مستقبل TVA في الجهاز العصبي المركزي. هذه التقنية تتيح تحليلاً عالي الإنتاجية للاتصالات العصبية وتوفر فهماً أعمق للشبكات العصبية المعقدة.

تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا

استكشف المزيد من الفيديوهات