استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

الهدف من الإجراء التالي هو توضيح كيفية الحفاظ على الجسيمات الحالة لنوعين من العينات ، أجنة الفئران والخلايا الجذعية المتمايزة باستخدام صبغة تعقب الليو للكشف عن أنماط موت الخلايا. لتحضير عينات الأجنة ، يتم أولا عزل الأجنة جراحيا ووضعها في طبق لتحضير الخلايا المتمايزة. تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية لإنشاء أجسام جنينية.

يتم زراعة هذه الأجسام الجنينية في معلق ثم تنمو كطبقة أحادية على شريحة الغرفة. يمكن احتضان الأجنة التي تبيع جميع الطبقة الأحادية باللون الأحمر ثم يتم شطفها ثم يتم تصوير عينات ثابتة لفحص وتحديد نتائج التلوين التي تظهر Liso Tracker. التلوين هو إجراء بسيط يمكن استخدامه لفحص موت الخلايا في الأجنة والخلايا المستنبتة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تحليل النفق هي أنه نظرا لأن صبغة تعقب OT عبارة عن جزيء صغير ، يمكن فحص الأنسجة السميكة بسرعة وسهولة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأنماط موت الخلايا المبرمج في أجنة الفئران والثقافات المتمايزة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الأنسجة الأخرى مثل أجنة الدجاج والخلايا الجذعية البالغة المتمايزة. قم بإقران إناث الفئران الصغيرة مع ذكر مسمار وفي صباح اليوم التالي ، تحقق من وجود سدادة مهبلية ، مما يشير إلى حدوث التزاوج.

الظهيرة في اليوم الذي تظهر فيه السدادة المهبلية هي 0.5 يوم فعليا. بعد القطن في اليوم الجنيني محل الاهتمام ، وقتل الأنثى وفقا للبروتوكولات المعتمدة وإزالة الرحم إلى طبق بتري بطول 10 سم مع BSS هانك وشطف أي دم. افصل الأجنة وأخرجها من الرحم.

قم بإزالة الأغشية الجنينية الزائدة وقم بشطف واحد على الأقل باستخدام BSS من Hank لإزالة الأنسجة الدخيلة والدم. احتفظ بالأجنة التي تم تشريحها على الجليد أثناء التنظيف. الآخرون.

تحضير خمسة ملليلتر من محلول تلطيخ الأجنة Liso Tracker. هذا حجم كاف لمجموعة أو مجموعتين من الأجنة. امزج المحلول برفق لتفريق الصبغة ، ثم انقل الأجنة بالتساوي إلى المحلول واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

بعد الحضانة ، اشطف الأجنة برفق في Hank's BSS أربع مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة. من المهم القيام بالشطف برفق حتى لا تتلف الأنسجة. قم بإزالة السائل ، مع الانتباه ببطء إلى مكان وجود الأجنة الرقيقة ، واترك دائما جزءا من السائل خلفها لتغطيتها.

ثم قم بإصلاح الأجنة في 4٪ بارا فورمالديهايد طوال الليل في اليوم التالي. اشطف الأجنة مرة واحدة في BSS الخاص بهانك لمدة 10 دقائق لإزالة المثبت. الآن قم بتجفيف الأنسجة من خلال سلسلة الميثانول للتخلص من تلطيخ الخلفية.

تعمل هذه الخطوة على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء التصوير قبل التخزين. إذا لزم الأمر ، اجمع عينة من الأنسجة من كل جنين للتحليل الجيني. في وقت لاحق ، أعد ترطيب عينة الأنسجة قبل التنميط الجيني.

افصل الأجنة إلى أنابيب فردية مع ملصقات تتناسب مع عينة الأنسجة. الآن من الممكن تخزين الأجنة المعزولة إلى أجل غير مسمى في الميثانول بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. محمي من الضوء.

ابدأ بتحضير أجسام الأجنة بطريقة القطرة المعلقة. بكثافة تبدأ تبلغ 500 خلية لكل قطرة 20 ميكرولتر بعد ثلاثة أيام ، انقل أجسام الجنين إلى مزارع معلقة على أطباق بتري غير الملتصقة بطول 10 سم. قم بثقافتهم لمدة خمسة أيام ، وقم بتغيير وسائل الإعلام كل يومين بعد خمسة أيام.

انقل أجسام الجنين إلى شرائح من ثماني غرف جيلاتينية ، ووضع جسم أو اثنين من أجنام الجنين في كل غرفة. استزراع أجسام الجنين لمدة 10 أيام أخرى. قم بتغيير الوسائط كل يومين بعد 10 أيام ، واستنشق الوسائط الموجودة برفق وأضف 300 ميكرولتر من محلول تلطيخ خلايا تعقب Lyo إلى كل غرفة.

احرص على إخراج الماصة يدويا من خلال وضع طرف الماصة في زاوية الغرفة. بهذه الطريقة ، لن تقوم بإزالة كل جسم عن طريق الخطأ ، مع الاستمرار في إرفاق كل جسم من السطح الزجاجي. عند إضافة الوسائط مرة أخرى ، ضع طرف الماصة في زاوية الغرفة وأضف الوسائط مرة أخرى ببطء شديد.

احتضان الغرف عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم اشطفها مرتين باستخدام DPBS لمدة خمس دقائق لكل شطف. الآن قم بإصلاح الخلايا في 4٪ بارالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة المثبت باستخدام DPBS في غسلتين لمدة خمس دقائق. لتركيب الأجنة ، ضعها في شريحة زجاجية عميقة أو درع صغير من صحن بتري. تحضير عينات الخلايا للفحص المجهري عن طريق شفط DPBS.

أخرج الغرفة من الشريحة واتركها تجف في الهواء لمدة خمس دقائق تقريبا. غطيها بورق الألمنيوم لحماية الفلورو. ثم أضف وسيطا مائيا مثل الدرع المتجه مع dappy وضع زلة غطاء في الأعلى.

الآن تم تركيب الشريحة وهي جاهزة للتصوير. تصور العينات باستخدام مجهر تشريح أو مركب مزود بقضيب أو دومين أو مرشح أحمر من تكساس. عادة ما يكون التلوين ساطعا جدا ، لذلك عادة ما تكون التعريضات الطويلة غير ضرورية في الوضع اليدوي.

التقط صورا رقمية لجميع العينات في ظل ظروف التعريض الضوئي نفسها. لتحديد كمية الصور ، افتحها في Adobe Photoshop أو برنامج تصوير مشابه. لتحديد مقدار تلطيخ تعقب ليو ، حدد القناة الحمراء.

لاحظ عدد وحدات البكسل للصورة بأكملها كما هو موضح في وظيفة الرسم البياني. العتبة التالية ، الصورة بحيث يتم تمثيل التلوين الأحمر الآن بوحدات بكسل بيضاء. يؤدي هذا إلى تحويل الصورة إلى أبيض وأسود.

اختر مستوى عتبة واستخدم هذا المستوى لجميع الصور في المجموعة. حدد وحدات البكسل البيضاء باستخدام أداة نطاق الألوان واستخدم وظيفة الرسم البياني للحصول على إجمالي عدد وحدات البكسل البيضاء. استخدم القناة الزرقاء لحساب عدد النوى في الحقل.

قد يكون من المفيد الاحتفاظ بسجل للعد عن طريق التعليق على الصورة وتسجيل القيم واستخدامها لحساب متوسط مستوى التلوين لكل خلية. كرر هذا التحليل بنفس إعداد الحد لجميع الصور المتبقية. لأخذ عينات من جهاز تعقب o تم استخدامه لتلطيخ الأجنة المتحولة للقنفذ الصوتي.

نظرا لأن متتبع ly O عبارة عن مناطق جزيئية صغيرة وقابلة للانتشار بدرجة عالية في عمق الجنين بأكمله كما تم تلطيخها بعد 10.5 يوما من موت الخلايا المبرمج أو PCG تمت زيادة كبيرة في الأجنة الطافرة القنفذية الصوتية ، خاصة في الأطراف وكذلك المناطق. تم تصوير براعم الأطراف في حوامل الثقب بتكبير أعلى لتقييم النمط العام. كما تم تقسيم الأجزاء المقطعة بميكروتون اهتزازي.

يشير رأس السهم إلى زيادة التلوين في الطرف البعيد الفارغ للقنفذ الصوتي في الأقسام التي تم الحصول عليها باستخدام تلطيخ نفق ناظم التبريد تم استخدامه جنبا إلى جنب مع OT Tracker في هذه الشرائح ، على الرغم من عدم وجود علاقة صارمة بين تعقب ليو وتلوين النفق ، فإن المناطق العامة ل PCD تتداخل بشكل كبير تحت تكبير أعلى. من الممكن رؤية ثقب ملطخ إيجابي بفحص النفق ، ولكن ليس ثقب قالب otra الذي يلطخ فقط بقالب الليرة والثقب اللذين لهما تلطيخ متداخل. بعد 10 أيام من زراعة جسم الجنين ، تمايزت خلايا الجسم إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية وخلايا العضلات وخلايا عضلة القلب.

في الثقافة الطبيعية لخلايا ES المتمايزة ، هناك عدد قليل من الخلايا التي خضعت لمركبات الكربون الكلوريدية كما تم اكتشافها باستخدام متتبع ليو ومقايسات النفق. تمت معالجة الخلايا التالية ببيروكسيد الهيدروجين للحث على موت خلايا الإجهاد التأكسدي. أدت جرعة منخفضة من بيروكسيد الهيدروجين إلى زيادة كل من تعقب الليو وتلوين النفق مقارنة بعدم العلاج.

على غرار النتائج في الجنين ، فإن كلا البقع تحمل خلايا شائعة وفريدة من نوعها. أدت جرعة عالية من بيروكسيد الهيدروجين إلى انكماش الخلايا وانتشار متتبع OT وإيجابية النفق. للمقارنة ، تم استخدام تجويع المصل للحث على الالتهام الذاتي بعد ساعة واحدة من تجويع المصل.

زادت تلطيخ تعقب OT. ومع ذلك ، ظلت إيجابية الأنفاق عند المستويات الطبيعية. وبالتالي ، في حين أن reer سهل ومفيد ، فمن المهم المتابعة بفحوصات إضافية لتحديد ما إذا كان التلوين يمثل موت الخلايا المبرمج أو الالتهام الذاتي بعد تحديد العينات.

باستخدام طريقة الفوتوشوب البسيطة التي تم عرضها سابقا ، أكدت النتائج أن زيادة تركيزات بيروكسيد الهيدروجين أدت إلى مستوى أعلى من تلطيخ متتبع ليز بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء إجراء التلوين هذا في أقل من ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل NX في خمسة أو LC ثلاثة تلطيخ مناعي من أجل تأكيد نوع موت الخلايا. لا تنس أن Trecker green يعمل حاليا فقط على الخلايا الحية ، لذا فإن Reca red هو خيارك الأفضل للعينات التي تتطلب التثبيت.