التهاب القرنية العقبولي المتكررة اللحمية في الفئران، وهذا نموذج لدراسة الإنسان HSK

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة العدوى المتكررة بفيروس الهربس البسيط أو HSV. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إصابة الفئران بطريقة تجعلها مصابة بشكل كامن دون حدوث تلف في القرنية. وبعد ترسيخ حالة الكمون بشكل كامل، تتمثل الخطوة التالية في إعادة تنشيط الفيروس عن طريق التعريض لأشعة UVB، وفي الخطوة النهائية، يتم جمع الغشاء الدمعي للكشف عن طرح الفيروس، ثم يتم مراقبة الفأر لمدة خمسة أسابيع على الأقل لمتابعة المرض.

في النهاية، يمكن تقييم مدى المرض الذي يحدث في الفئران من خلال تسجيل درجات المرض لالتهاب القرنية السدوية الهربسي. هذا المرض يصيب الكثير من الناس حول العالم، ويعد أحد الأسباب الرئيسية للعمى المعدي.

لدينا نموذج نستخدمه في الفئران لمحاكاة هذا المرض تحديداً. توجد نماذج أخرى يمكنها في الواقع محاكاة هذا المرض، ولكننا نرى أن هذا النموذج هو التمثيل الأفضل لهذا المرض بالتحديد. أود أن أخصص بضع دقائق اليوم لتقديم الأشخاص الذين ستراهم في هذا الفيديو.

هذه كلوي التي تعمل معي منذ عدة أشهر. وهذا نيبو، وهو طالب صيفي يعمل في المختبر. ابدأ التجربة بتنمية HSV one على خلايا Vero لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصل نسبة التلاقي إلى 80% في قارورة T one 50.

ستكون الخلايا قد تجمعت في شكل كروي بحلول هذا الوقت، وسيكون من السهل فصلها عن طريق نقر القارورة. انقل معلق الخلايا إلى أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 milliliter، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 15 minutes. اضبط الجهاز على 1, 510 ×g عند درجة حرارة four °C في جهاز طرد مركزي مكتبي.

بعد ذلك، انقُل السائل الطافي إلى أنابيب Oak Ridge معقمة سعة 50 milliliter، ثم وزع ما مجموعه خمسة milliliters من الوسط الزرعي بين كل أنبوب مخروطي لإعادة التعليق. قم بتعليق الرواسب الكبيرة، ثم عرض الرواسب المعاد تعليقها للموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة على هيئة نبضتين مدة كل منهما 32 من الثانية. بعد طرد السائل الطافي مركزياً في جهاز طرد مركزي أرضي عالي السرعة، يتكون راسب فيروسي صغير.

بعد التخلص من الطافي، ادمج الرواسب مع كتل فيروسية صغيرة ثم قم بعملية السونكة مجدداً لمدة 45 ثانية. الآن، قم بطرد محلول الخلايا والفيروسات المعالج بالسونكة في جهاز الطرد المركزي المكتبي مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند 280 ×g ودرجة حرارة 4 °C، ثم قم بتقسيم الطافي إلى حصص لتخزينه كمخزون فيروسي عند -70 °C أو لاستخدامه في طبق المعايرة.

تخفيفات عشرية للفيروس من السائل الطافي للمخزون الفيروسي من 10⁰ إلى 10⁻⁸، مرتين من مجموعتين منفصلتين من تخفيفات خلايا Vero في أطباق معقمة ذات 12 بئراً. ابدأ إجراء العدوى بتخدير الفأر، ويجب أن يظل الفأر مخدراً بالكامل لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح بامتصاص الفيروس قبل أن يستيقظ الفأر.

بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي، استخدم إبرة بقياس 30 gauge لخدش قرنية العين اليمنى. الآن، قم بترقيم الحيوان عن طريق ثقب الأذن. بعد ذلك، احقن الفأر بـ 1 mL من مصل بشري مجمّع لحماية القرنيات من التلف أثناء العدوى الأولية.

استخدم بعد ذلك ماصة سعة 20 µL لإصابة العين المخدوشة بـ 10⁶ plaque forming units، وضع 5 µL من HBSS في العين الأخرى للحفاظ على رطوبتها أثناء تخدير الحيوان للتأكد من حدوث العدوى. قم بترطيب مسحة قطنية معقمة بـ 1 mL من وسط Vero. بعد ثلاثة أيام من الإصابة، امسح العين المصابة باستخدام المسحة، ثم انقل 100 µL من الوسط الممسوح إلى خلايا Vero المستنبتة في أطباق ذات 48 بئراً، وذلك بعد مرور خمسة أسابيع على الأقل من العدوى الأولية.

قم بمسح العين المصابة للفأر المخدّر كما هو موضح تماماً. حدد عملية المسح بأنها اليوم صفر على غطاء طبق الـ 48 بئراً للتحكم في الرمش التلقائي. بعد ذلك، ضع الفأر في جهاز إرسال الضوء (transluminator) الذي يمكنه إصدار أشعة UVB بطول موجي ذروي يبلغ 302 نانومتر، بحيث تتعرض عين واحدة فقط لأشعة UVB، وعرّض الفأر لـ 250 millijoules من أشعة UVB لكل سنتيمتر مربع.

بعد ذلك، يتم مسح العين يومياً من اليوم الأول وحتى اليوم السابع. وفيما يخص المسحات التي تحتوي على فيروسات معدية بعد التشعيع بـ UVB، يتم تحديد كمية الفيروس عن طريق مقايسة اللويحات القياسية باستخدام أطباق ذات 12 بئراً لتقييم الإصابة بأمراض العين السريرية في الفئران. ضع الفأر تحت مجهر تشريحي ثنائي العينين.

يتم تقييم عتامة القرنية على مقياس من صفر إلى أربعة، حيث يشير الصفر إلى سدى (stroma) صافية، ويشير الواحد إلى تعتيم سدوي خفيف. ويشير الرقم اثنان إلى عتامة متوسطة مع إمكانية تمييز القزحية. أما الرقم ثلاثة فيشير إلى عتامة كثيفة مع فقدان تفاصيل القزحية المحددة باستثناء حواف الحدقة، ويشير الرقم أربعة إلى عتامة كلية مع انعدام الرؤية الخلفية.

يتم تقييم التوعي الحديث (Neovascularization) على مقياس من واحد إلى ثمانية عن طريق تقسيم القرنية إلى أربعة أرباع متساوية وتحديد مدى التوعي في كل من هذه الأرباع. في هذا الشكل الأول، تم تحفيز الفئران المصابة بشكل كامن على إعادة تنشيط العدوى باستخدام الأشعة فوق البنفسجية من النوع B (UVB)، ثم تمت مراقبة عتامة القرنية لدى الفئران لمدة 35 يوماً. وتظهر هذه البيانات أن ذكور الفئران من سلالة C 57 black six تظهر عتامة في القرنية أقل بكثير مما تظهره إناث الفئران من سلالة C 57 black six، حيث كان المرض الناجم عن الفيروس أكبر بكثير في إناث الفئران من سلالة C 57 black six في الأيام من 14 إلى 35.

وبالمثل، عند تقييم تكوّن الأوعية الدموية في القرنية تحت نفس الظروف التجريبية، أظهرت ذكور الفئران نمواً أقل بكثير في الأوعية الدموية الجديدة في القرنية مقارنة بإناث الفئران، ومرة أخرى، يظهر المرض الناجم عن الفيروس بشكل أكبر بكثير في إناث فئران C 57 black six في الأيام من 14 إلى 28. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، تذكر تخدير الفئران تخديراً كاملاً بحيث تظل في حالة نوم لمدة تتراوح بين 20 و30 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، آمل أن يكون لديك فهم لكيفية استخدام نموذج الفأر لالتهاب القرنية السدوية المتكرر لدراسة هذا المرض البشري.