الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

تنص هذه المادة على بروتوكول للزراعة شتلات Arabidopsis في RootChip، منصة التصوير ميكروفلويديك الذي يجمع بين التحكم الآلي من شروط النمو مع مراقبة جذر المجهرية والحنق القائم على قياس مستويات الأيض داخل الخلايا.

من أجل توفير أقصى قدر من الغلة ، يجب تزويد النباتات بمجموعة من العناصر الغذائية أو نقص المغذيات أو الضغوط مثل البرودة أو الحرارة الشديدة أو الجفاف أو مسببات الأمراض التي تسبب خسائر فادحة في غلة المحاصيل كل عام. غالبا ما يكمن أصل العديد من هذه المشاكل تحت الأرض. الجذر هو المرساة المادية للنبات ، ولكنه أيضا العضو المسؤول عن امتصاص الماء وامتصاص العناصر الغذائية المعدنية مثل النيتروجين وكبريتات الفوسفور والعديد من العناصر النزرة.

إذا أردنا تطوير مناهج مستدامة لإنتاج غلة عالية من المحاصيل ، فنحن بحاجة إلى فهم أفضل لكيفية تطور الجذور ، وكيف تمتص هذه المجموعة الواسعة من العناصر الغذائية وكيف تتفاعل مع الكائنات التكافلية والممرضة. للقيام بذلك ، نحتاج إلى أن نكون قادرين على استكشاف الجذور على المستوى المجهري لأسباب واضحة. لطالما كانت دراسة بيولوجيا الجذور أكثر صعوبة من دراسة الأجزاء الهوائية من النبات.

نظرا لأن الجذور عادة ما تكون مخفية تحت الأرض ، فلا يمكن الوصول إليها بسهولة للدراسات المجهرية. تتسبب الإزالة من التربة في أضرار جسيمة لنظام الجذر وبالتالي فهي ليست طريقة جيدة لدراسة سلوكهم. أحد الحلول لجعل الجذور أكثر سهولة هو زراعتها على jeed أو يظهر في هذا المثال في الوسائط المائية.

استخدام خطط النمو في الوسائط الهلامية أو في الوسائط المائية بنجاح كبير في العديد من دراسات الجذر ، ولكن مع هذه الطرق ، لا يزال من الصعب جدا دراسة الجذور بالتفاصيل المجهرية وعلى مدى فترات طويلة من الزمن للاقتراب قدر الإمكان من الجذر المتنامي وتجنب أي إجهاد بدني من التحضير للتصوير ، نحن نبني منصة تسمح لنا بالنمو وتصوير الجذور ، وفي نفس الوقت تسمح لنا بالتحكم في البيئة المكروية للجذور وتعديلها بدقة وسرعة عالية جدا. هذه المنصة أطلقنا عليها اسم شريحة الجذر. شريحة الجذر عبارة عن جهاز ميكروفلويدي مصنوع من PDMS ، وهو بوليمر عضوي قائم على السيليكون.

تتميز الرقاقة بغرف مراقبة لنمو وتصوير الجذور من شتلات الأرانب. تنبت البذور أولا في مخاريط بلاستيكية مصنوعة من أطراف ماصة بلاستيكية ، والتي نملأها بوسائط صلبة. ثم ينمو طرف الجذر من خلال الوسط ويصل إلى الغرفة حيث يشهد تدفقا مستمرا للوسط السائل ، مما يحافظ على الظروف في الغرفة.

الصمامات الميكانيكية الدقيقة الثابتة التي طورها مختبر ستيف كويك في جامعة ستانفورد هنا بتحكم أحمر. التدفق نظرا لأن الرقاقة مثبتة على زجاج غطاء شفاف كما هو الحال عادة في الفحص المجهري ، يمكن مراقبة جميع العمليات في غرفة المراقبة على مجهر مقلوب. يمكن رؤية بنية القناة المتشعبة التي توجه تدفق السوائل تحت المجهر.

تتكون شريحة الجذر من طبقتين ، طبقة تحكم تحتوي على الصمامات في طبقة تدفق تحتوي على القنوات التي تتدفق من خلالها حلول اختبار وسائط النمو إلى غرف المراقبة. حجم هذه الغرف حوالي 400 نانولتر. هذا يعني أن هناك حاجة إلى كميات صغيرة جدا من المحلول ويمكن تغيير الظروف بسرعة كبيرة.

يصف هذا البروتوكول كيفية تحضير الجذور الحية لثمانية شتلات أو نبات الأرابيدوبسيس للتصوير المجهري المتوازي على شريحة الجذر ومراقبتها لمدة تصل إلى ثلاثة أيام تبدأ بملء طبق بتري 10 ملم بوسط نمو يحتوي على 1٪ أجار بينما الوسط لا يزال سائلا. املأ أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر بخمسة ميكرولترات من الوسط من طبق بتري باستخدام ماصة متعددة القنوات. يتم تخزين الأطراف المملوءة في صندوق طرف الماصة حتى يصبح الوسط صلبا.

ثم تقطع إلى مخاريط بلاستيكية بطول أربعة ملليمترات وتوضع في وضع مستقيم في طبق بتري يحتوي على وسط نمو صلب. بعد التعقيم السطحي ، توضع بذور مفردة فوق المخاريط المملوءة بالوسائط. ثم يتم إغلاق الطبق بشريط دقيق المسام ويتم تخزين اللوحة عند أربع درجات لمزامنة الإنبات.

بعد ثلاثة أيام ، يتم نقل الألواح إلى خزانة النمو لبدء الإنبات. ظروف نمونا في هذه التجربة هي 23 درجة. عند تسليط الضوء على 16 ساعة ، ودورة ظلام ثماني ساعات بين خمسة وسبعة أيام بعد الإنبات ، يجب أن تكون الشتلات جاهزة للنقل إلى طول جذر صحة شتلة رقاقة الجذر ، وإذا أمكن ، يجب التحقق من التعبير عن علامة الفلورسنت تحت مجهر تشريح.

بمجرد أن تصل أطراف جذر الشتلات إلى المخرج السفلي للمخروط البلاستيكي ، يتم وضع علامة على الشتلات الفردية لنقلها إلى الشريحة. 10 أو نحو ذلك يجب اختيار شتلات النبات في حالة تلف أحدها أثناء النقل لتعقيم شريحة الجذر. للتجارب طويلة الأمد ، يتم لف الجهاز بأنسجة ورقية ، ويوضع في طبق بتري زجاجي وأوتوكلاف.

هذه الشريحة كانت الأوتوكلاف من قبل. التجربة بعد تبريد الرقاقة متراكبة مع السائل النمو الوسائلة. يجب تغطية الشريحة بالكامل ، ولكن يجب ألا يزيد مستوى السائل عن ثلاثة ملليمترات فوق سطح الشريحة.

يتم استخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر لسحب الوسائط عبر مدخل الجذر ومخرج الحجرة. هذا يملأ غرفة المراقبة. مع الوسائط المختارة ، يتم الآن توصيل المخاريط البلاستيكية بشريحة الجذر.

يجب أن يتناسب المخروط بشكل مريح مع المداخل. نظرا لأن شريحة الجذر مثبتة على طبقة رقيقة من الزجاج البصري ، يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم الضغط الشديد على الشريحة. خلال هذه الخطوة ، يتم الآن تحضير الشريحة للحضانة الليلية داخل وسائط Liquid لمنع الشريحة من الطفو.

وضع شريحتين زجاجيتين ، واحدة مقطوعة إلى نصفين على الشريحة. يضاف شريط تحريك مغناطيسي ويغلق الطبق. يتم الآن نقل التجميع إلى تحريك مغناطيسي ، والذي سيثير الوسط برفق لتسهيل نمو الجذور باتجاه المنافذ.

رقاقة الجذر. يتم ثقب المداخل بزاوية لدعم النمو في الاتجاه المطلوب. قم بإمالة التجميع قليلا عن طريق رفع جانب الرقاقة المقابل للمنافذ.

الشريحة مضاءة بمصباح دائري متصل بمفتاح مؤقت للحفاظ على الإيقاع الفاتح الداكن. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم تحضير وسائط النمو السائل في قارورة قابلة للضغط قابلة للغلق. يجب تنفيذ الخطوات التالية بسرعة ودون انقطاع لمنع جفاف الشتلات.

تتم الآن إزالة الرقاقة من الوسط السائل ووضعها رأسا على عقب في الفتحة السفلية لحامل الرقاقة ، والذي يتم نقلوبه أيضا. يجب توجيه الرقاقة بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على مداخل طبقة التحكم مواجها جانب خط الضغط. موصلان كبيران في الجدار الجانبي للحامل.

يتم تجفيف زجاج الغطاء الموجود في الجزء السفلي من الشريحة عن طريق النشاف برفق بالمناديل الورقية وتثبيته على الناقل. باستخدام الشريط ، يتم بعد ذلك قلب التجميع بأكمله. تمتلئ موصلات الأنابيب بالماء باستخدام حقنة ، ويتم توصيل كل موصل أنبوب بالمدخل المقابل.

على الشريحة. يتم توصيل الأنابيب بالوسائط والمحلول. ثم تتم إزالة القوارير والهواء من الخطوط عن طريق الضغط على الصفراء المحلولة بحقنة من الهواء ، ويتم تغطية الناقل بالبلاستيك الشفاف.

للحفاظ على رطوبة عالية في التجميع ، يتم وضع الناقل على مرحلة المجهر. يجب أن تتناسب تماما مع شقوق المسرح. يتم التحكم في صمامات الرقاقة ، وكذلك تدفق الوسط عبر الرقاقة عن طريق ضغط الهواء.

يتفرع خطان مع منظمات من خط ضغط رئيسي. يستخدم أحدهما للتحكم في تدفق السوائل والآخر متصل بصمامات هواء الملف اللولبي. يتم تشغيل هذه الصمامات من الكمبيوتر عبر وحدة التحكم في صمام USB وهي مسؤولة عن تشغيل الصمامات الموجودة على الشريحة.

يجب إغلاق كلا منظمي الضغط قبل توصيل الشريحة. يتم الآن توصيل الأنابيب والموصلات وقوارير المحلول بخطوط الضغط المقابلة. يضاف بضعة ملليلتر من الماء إلى خزانات الناقل.

قد تحتاج هذه الخطوة إلى التكرار على مدار تجارب أطول. للحفاظ على الرطوبة عالية ، حافظ على حمل الحجم لتقليل الكمية المحتملة من السائل الذي يمكن انسكابه على المجهر. يتم تحريك الضوء الدائري إلى موضعه فوق الرقاقة للحفاظ على الدورة المظلمة الفاتحة حتى تبدأ التجربة.

يتم إغلاق الصمامات الموجودة على الرقاقة عن طريق الضغط في هذه الحالة عن طريق فتح صمامات الهواء اللولبي. تسمح واجهة عرض المختبر بالتحكم في الصمامات بالنقر فوق الزر الموجود أسفل رقم الصمام. يشير اللون الأخضر الفاتح إلى تطبيق الضغط وإغلاق صمام الرقاقة.

هذا المخطط تنظيم نظام الصمامات بينما تعمل الصمامات من أربعة إلى ثمانية كصمام صمامات مفردة من الصفر من خلال ثلاثة أفعال. في المجموعات مع هذا النظام ، يمكن معالجة غرفة فردية عن طريق تنشيط مجموعة من الصمامات ، على سبيل المثال ، لتوجيه تدفق السائل حصريا إلى الغرفة الثالثة من الصمامات العلوية صفر ، يجب إغلاق ثلاثة وأربعة. بالإضافة إلى ذلك ، يتحكم الصمام ستة وسبعة وثمانية في المحلول المستخدم لتنظيف المداخل A و B و C الآن بتنشيط جميع صمامات مدخل المحلول الثلاثة لإغلاقها.

واجهة وحدة التحكم بحلقة تغذية مرتدة ، والتي تسمح بمراقبة حالة النظام. يمكن تنشيط هذه الميزة بالنقر فوق زر القراءة مرة أخرى. منظم الضغط لطبقة التحكم مفتوح أولا ويتم ضبطه على 15 رطل لكل بوصة مربعة.

ثم يتم فتح منظم طبقة التدفق وضبطه على خمسة رطل لكل بوصة مربعة. يتم فتح صمام المدخل لوسط النمو المفضل ويتم مسح الغرف بمسارات تدفق الوسائط التي يجب فحصها تحت المجهر. في معظم الحالات ، يتم احتجاز الهواء في القنوات ويجب إزالته.

بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال قنوات هواء التحكم تحتوي على هواء يجب إجباره على الخروج واستبداله بالماء من موصلات الأنابيب. هذه العملية تسمى ملء الطريق المسدود. يتم تحقيق كلتا المهمتين عن طريق شطف كل غرفة من الغرف الثماني عدة مرات حتى يتم دفع كل الهواء من القنوات إلى PDMS.

يمكن برمجة النظام لأتمتة التجارب. يمكن أيضا استخدام هذه الإجراءات لتفريغ الرقاقة. الغرض الرئيسي من رقاقة الجذر هو الجمع بين منصة التصوير ونظام الوفرة في جهاز واحد.

لإثبات التلاعب بالبيئة الدقيقة للجذور ، قمنا بغسل الغرف بالصبغة وقمنا بقياس تبادل السوائل داخل الغرف. عند الضغط الموصى به البالغ خمسة رطل لكل بوصة مربعة ، قمنا بقياس التبادل الكامل في غضون 10 ثوان بمعدل تدفق محسوب يبلغ حوالي 1.5 ميكرولتر في الدقيقة. لاحظنا أيضا نمو جذر الشتلات في هذه الحالة المزروعة في الظلام ومزودة ب 10 مللي مولار من الجلوكوز كمصدر خارجي للطاقة.

اعتمادا على ظروف النمو مثل الضوء وتكوين الوسط ، يمكن ملاحظة النباتات في رقاقة الجذر لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. تم استخدام هذا النظام لمراقبة مستويات الجلوكوز والجالاكتوز داخل الخلايا في الجذور التي تعبر عن أجهزة الاستشعار النانوية المشفرة وراثيا. تم تطوير هذه المستشعرات القائمة على نقل الطاقة الأول أو الرنين أو الحنق في مختبر فرومر.

في هذه التجربة ، تم غرس الجذور في الرقاقة بنبضات مربعة من محلول الجلوكوز أو الجالاكتوز. تمت مراقبة مستويات السكريات داخل الخلايا ويتم عرضها هنا ، معبرا عنها كنسبة من شدة الفلورو أربعة سيترين المستقبل إلى شدة ECFP المتبرع إلى اليسار. نلاحظ كمية المستشعرات من السترين في الصورة الوسطى أو المترية النسبية لطرف الجذر ، وإلى اليمين ، نتتبع كمية السكر استجابة لثلاث نبضات مربعة متكررة من الجلوكوز باللون الأخضر والجالاكتوز الموضحة باللون الأحمر.

يشير ارتفاع النسبة إلى تراكم السكر. تتمثل المزايا الرئيسية لشريحة الجذر على طرق النمو التقليدية في التحضير طفيف التوغل للفحص المجهري ، والقدرة على تغيير بيئة الجذر بشكل عكسي ومتكرر والقدرة على المراقبة المستمرة للأنسجة المختصة نمويا والصحية من الناحية الفسيولوجية على مدى أيام. ميزة أخرى مهمة حقا هي أن هناك حاجة إلى كميات قليلة فقط من السوائل لتزويد الجذور بجميع العناصر الغذائية الضرورية بمرور الوقت.

هذا يجعل شريحة الجذر فعالة للغاية من حيث التكلفة ، خاصة عند استخدام الكواشف باهظة الثمن. نواصل تحسين شريحة الجذر وتوسيع قابليتها للاستخدام لأننا نعتقد أنه من خلال جعل هذا العضو المهم متاحا بشكل أفضل للعلاجات والمراقبة ، من المحتمل أن تفتح أدوات الموائع الدقيقة مثل شريحة الجذر أبعادا جديدة لأبحاث النبات. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول كيفية بناء نظام رقاقة الجذر على موقعنا على الإنترنت.

يمكن طلب الرقائق من مسبك ستانفورد.