دراسة BCL-2 وظيفة الأسرة مع حويصلات كبيرة Unilamellar

يحاكي نظام النموذج المحدد كيميائياً حيوياً هذا من الحويصلات الكبيرة (Large Ella Vesicles) الغشاء الميتوكوندري الخارجي لمراقبة وظيفة بروتينات BCL two في المختبر (in vitro). أولاً، اخلط الليبيدات وكون غشاءً ليبيدياً في قارورة محكمة الإغلاق. ثم قم بتحضير محلول LUV طازج وأذب الغشاء الليبيدي.

بعد ذلك، قم ببثق المحلول الدهني وتنقية الحويصلات الدهنية الكبيرة (LUVs) عن طريق الترشيح الهلامي. تتمثل الخطوة النهائية في تحليل الحويصلات الدهنية الكبيرة (LUVs) للتحقق من زيادة الفلورة الناتجة عن المنظفات. وفي النهاية، يُستخدم نظام نموذج الحويصلات الدهنية الكبيرة (LUV) لتقييم وظيفة وتنظيم البروتينات النفاذة عبر الغشاء مثل بروتينات BCL2 المؤتلفة.

يتميز هذا النهج الذي يستخدم حويصلات أحادية الطبقة كبيرة بعدة مزايا مقارنة بالأنظمة الموجودة مثل الميتوكوندريا. وبما أنها تُنتج باستخدام دهون منقاة في غياب البروتينات، فإنها تكون محددة كيميائيًا حيويًا من حيث التركيب والحجم.

يتيح ذلك تفسيرات واضحة للنتائج بما أن البروتينات الوحيدة في بحثك هي تلك التي تقوم بإضافتها. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى ميكانيكية حول قدرة عائلة BCL two على تنظيم سلامة الغشاء الميتوكوندري الخارجي. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى تبحث في إعادة تشكيل الغشاء والنشاط النفاذي.

سيشمل ذلك آليات الديناميكا الميتوكوندرية أو السموم التي تفرزها البكتيريا. يتم العمل داخل خزانة استخلاص من الأدخنة (fume hood) مع توفير إضاءة خافتة. اشطف محقنة زجاجية من نوع Hamilton Gast باستخدام الكلوروفورم.

بعد ذلك، في قارورة زجاجية GL سعة 1.5 milliliter، اجمعي أربعة milligrams من الدهون المذابة في الكلوروفورم. ثم لإزالة الكلوروفورم، وجهي تياراً لطيفاً من غاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون. وبعد مرور ساعتين إلى ثلاث ساعات، تحقق من تكون غشاء دهني جاف على قاع وجوانب القارورة في محلول LUV buffer.

قم بتحضير محاليل بحجم 500 µL من صبغة polyanion ومخمد CAS الأيوني مع الرج بجهاز vortex. اخلط المحاليل. ثم ادمج محاليل A NTS و DPX مع الرج بجهاز vortex لمدة دقيقة واحدة، ثم استخدم حماماً مائياً فوق صوتياً لضمان ذوبان المحاليل بالكامل وتجانسها.

أضف الآن محلول A-N-T-S-D-P-X إلى الغشاء الليبيدي وأغلق القارورة باستخدام شريط البارافيلم (para film)، ثم قم بمعالجة الغشاء الليبيدي بالموجات فوق الصوتية (sonication) لمدة خمس دقائق. سيظهر المحلول بمظهر حليبي بعد عملية السونيكشن. تأكد من ذوبان المحلول تماماً، حيث إن التجمعات الليبيدية الصغيرة ستؤثر سلباً على الخطوات التالية. كما يجب فحص قاع وجوانب القارورة للتأكد من عدم وجود أي بقايا من الغشاء الليبيدي.

قم بتجميع جهاز البثق وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة، مع استخدام محلول LUV المنظم لترطيب دعامات المرشح وغشاء البولي كربونات. أحكم إغلاق غطاء الوحدة بحيث لا يحدث فقد في الحجم أثناء عملية البثق، ولكن دون إفراط لتجنب تمزق الغشاء. اختبر جهاز البثق باستخدام محلول LUV المنظم للتأكد من عدم وجود تسريبات أو مشكلات. الآن، املأ المحقنة اليمنى بالمحلول الدهني وقم بالبثق 31 مرة لضمان مرور حويصلات ELLA الكبيرة عبر الغشاء مرة واحدة على الأقل وتجميعها في المحقنة اليسرى. قد تتطلب عمليات البثق القليلة الأولى ضغطاً أعلى قليلاً إذا مر المحلول فجأة وبسرعة عبر الغشاء.

افحص الغشاء للتأكد من عدم تمزقه واستبدله عند الضرورة. أضف المحلول إلى العمود في خطوة واحدة، وتجنب إزعاج السطح البيني للخرز.

اترك المحلول المنظم يتدفق حتى يخرج تماماً من العمود. وعندما يتوقف التدفق، قم بسد العمود وملئه بلطف بمحلول LUV المنظم، مع الحرص على عدم تحريك الحبيبات. بعد ذلك، قم بإزالة السداد وجمع ستة أجزاء، سعة كل منها 1 mL.

تخرج الحويصلات الاصطناعية أحادية الطبقة (AUVs) عادةً في الأجزاء الثالث والرابع، ويمكن التعرف عليها من خلال المظهر العكر لإعادة تدوير غسيل العمود وتخزينه عند درجة حرارة 4 °C. أما الحويصلات الاصطناعية غير أحادية الطبقة (UUVs) في جزء العمود فيتم الكشف عنها من خلال زيادة الفلورة بسبب وجود الـ chaps. تذكر استخدام أطباق 96 بئراً معتمة سوداء لجميع دراسات الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUVs).

قم بماصة 100 µL من محلول LUV المنظم أو محلول LUV مضافاً إليه 0.5% chaps في ستة آبار. أضف إلى كل بئر خمسة µL من الكسر المناسب وامزج من أجل biotech H one synergy. افتح برنامج gen five 2.0، وحدد طول موجة الإثارة 355 nanometers وطول موجة الانبعاث 520 nanometers.

اضبط جهد الكسب عند الموضع البصري 125 في الأعلى، وارفع ارتفاع القراءة بمقدار 5.5 millimeters. الآن قم بقراءة الطبق عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وحدد الكسور التي تحتوي على LUV. اسحب كسور LUV المنقاة.

صُممت هذه المقاييس لقياس قدرة بروتينات BCL2 على تحفيز نفاذية LUV بشكل مباشر، وكذلك لتنظيم نشاط النفاذية. امزج مكونات المقاييس حسب ترتيب الإضافة. تتوفر التفاصيل الموضحة حول معايرات بروتينات BS و bid في المخطوطة المرفقة.

قم بتحضين التفاعلات عند 37 °C لنقاط زمنية محددة للمقايسة. أدخل اللوحة في قارئ الألواح الدقيقة، والذي سيقوم برج اللوحة وقياس الفلورية كما هو موضح سابقاً. تستخدم هذه التجربة مواد خلفية منشطة بمنظف OG لإنشاء ضابط موجب لنفاذية LUV.

ومن الجدير بالذكر أن تركيزات OG التي تقل عن 0.025% لا تؤثر بشكل مباشر على نفاذية LUV هنا. كما تُستخدم معالجة بـ chaps بنسبة 0.5% لتحديد الكمية القصوى من فلورة LUV لكل مقايسة. إن نقطة البداية الضرورية لدراسة نفاذية LUV باستخدام بروتينات عائلة BCL-2 هي تحديد تركيزات backs و bid لتعزيز التحرر الأمثل.

تظهر منحنيات المعايرة هذه لـ backs و bid الحد الأدنى من الإطلاق الخلفي والتآزر الأمثل. وبدلاً من ذلك، يمكن قياس نفاذية LUV حركياً. وقد أُجريت هذه القراءات كل دقيقتين لمدة 30 دقيقة، مع رج لطيف للصفيحة لمدة ثانيتين قبل كل قراءة.

تحدد هذه التجربة تأثير بروتين مضاد لموت الخلايا المبرمج على نفاذية LUV المعتمدة على backs و bid هنا. يثبط BCL XL نشاط backs و bid بطريقة تعتمد على الجرعة. وفي مقايسة D repression، يمكن عكس التأثير المثبط من خلال إضافة بروتينات BH three اللاحقة فقط.

على سبيل المثال، يرتبط puma beta بـ BCL xl، مما يسمح لـ backs و bid بالعمل بتآزر وتحفيز النفاذية. وبمجرد إتقان هذه التقنية لتوليد حويصلات ELLA الكبيرة، فإنها تتيح التحليل الفعال والسريع لبروتينات عائلة BCL two والببتيدات والجزيئات الصغيرة في بيئة محددة كيميائيًا حيويًا تشبه الغشاء الميتوكوندري الخارجي. والأهم من ذلك، أن هذا المقايسة تسمح بالتحليل السريع لمئات الظروف باستخدام كل من نقاط النهاية والمعاملات الحركية.

لا تنسَ أن كلا البروتينين UUVs و BCL two عرضة بشدة للتداخلات الناتجة عن المنظفات. استخدم أدوات نظيفة وخالية من المنظفات لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.