تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

تستخدم هذه التجربة التعديل الانتقائي لنظائر بروتين كينيز C لتحديد وظائفها الميتوكوندرية والخلوية في خلايا الأنابيب القريبة الكلوية تحت ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. أولاً، يتم عزل خلايا الأنابيب القريبة الكلوية الأولية من القشرة الكلوية أو RPCs التي تتميز بتمثيل غذائي تأكسدي يشبه ذلك الموجود في الأنابيب القريبة الكلوية.

قم بإصابة الخلايا السليفة للشبكية (RPCs) باستخدام ناقلات غدية تعبر عن أشكال نشطة وغير نشطة من بروتين كيناز البروتين C. بعد ذلك، قم بفحص الوظائف الميتوكوندرية المختلفة وحيوية الخلايا لتحديد تأثير الإنزيم على قدرة الميتوكوندريا على تخليق ATP ومنع موت الخلايا. قم أيضاً بإجراء تحليل لطخة مناعية (immuno blot) لبروتين كيناز البروتين C epsilon المفسفر في المستخلصات الخلوية التي تم جمعها معاً.

تظهر النتائج أن تنشيط البروتين كينيز إبسلون ينظم سلباً قدرة الميتوكوندريا على توليد ATP، مما يقلل من مستويات ATP الخلوية ومن حيوية خلايا الأنابيب القريبة الكلوية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بتقنياتنا الحالية، مثل الخطوط الخلوية، في أن المزارع الأولية لخلايا الأنابيب القريبة الكلوية تحافظ على الوظائف المتمايزة والتمثيل الغذائي التأكسدي للأنابيب القريبة الكلوية. وبما أن البروتين كينيزات يمكن استخدامها كأهداف وعوامل علاجية محتملة، فإن تطبيقات هذه التقنية تمتد نحو العلاج، ومنع إصابة الكلى أو تسريع تعافيها بعد الإصابة.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول آلية الإصابة والتعافي. كما يمكن تطبيقها على مثل الـ و Per كلى الأرانب المعزولة حديثاً بالتتابع باستخدام 50 milliliters من وسط D-M-E-M-F 12 المعقم، ومحلول الفوسفات المنظم الملحي المعقم، pH 7.4، ومحلول PBS iron oxide لجمع القشرة من كل كلية.

قم أولاً بتجانس النسيج باستخدام جهاز تجانس سعة 15 milliliter. ثم مرر المادة المتجانسة عبر غربالين شبكيين معقمين في دورق معقم سعة لتر واحد. اشطف الخلايا المتبقية على الغرابيل باستخدام محلول منظم يحتوي على الـ deferoxamine.

انقل أي أنسجة متبقية في قاع المنخل ذو الـ 85 micron إلى 40 milliliters من المنظم المحتوي على deferoxamine والموضوع في أنبوب طرد مركزي مخروطي. اخلط معلق الخلايا برفق باستخدام المغناطيس القوي.

التقط الكبيبات المليئة بالحديد وقم بسحب الحديد الملتصق بالمغناطيس. اضبط حجم معلق الخلايا ليصبح 40 milliliters وأضف one milliliter من وسط الهضم الذي يحتوي على collagenase. يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 17 minutes.

خلط المعلق برفق. يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 50 ×g لمدة دقيقتين عند درجة حرارة 4 °C بعد عدة عمليات غسيل. أعد تعليق كتل الخلايا في 46 مل من الوسط الذي لا يحتوي على الجلوكوز.

يتم استنبات الخلايا الظهارية المبطنة للشبكية (RT PCs) الأولية بكثافة ملليجرام واحد من البروتين لكل طبق استنبات في 2 مل من وسط D-M-E-M-F 12 الخالي من الجلوكوز على هزاز مداري عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. بعد استكمال الوسط الغذائي، يتم إصابة خلايا RPT الملتصقة بـ adenovirus يحمل CD NA إما لبروتين كيناز C إبسيلون النشط بنيويًا، أو لبروتين كيناز C إبسيلون السلبي السائد؛ ثم تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة، ويُستكمل الوسط الغذائي وتُستنبت خلايا RPC الأولية المنقولة لمدة 24 ساعة أخرى. ولتصوير مورفولوجيا الميتوكوندريا في الطبقة أحادية الخلايا الأولية، يتم استكمال الوسط الغذائي، وإضافة MIT tracker red 580، ثم إعادة الأطباق إلى المحضنة لمدة 30 دقيقة.

ثم افحص الطبقات الأحادية الحية تحت مجهر فلوري باستخدام عدسة غمر مائية. الهدف الثاني: لتقييم الوظيفة الميتوكوندرية، قم بتقييم تنفس الحالة الثالثة لمعلق RPTC في غرفة استهلاك الأكسجين المجهزة بقطب كهربائي من نوع Clark.

أولاً، قم بقياس تنفس الحالة الثانية في غياب الفوسفات (DP). ثم أضف الفوسفات (DP) ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.4 millimolar. لبدء تنفس الحالة الثالثة للانتقال إلى تنفس الحالة الرابعة، أضف oligomycin ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.5 micrograms per milliliter.

قم أيضاً بتضمين قياس للتنفس غير المقترن عن طريق إضافة 0.5 micromolar من FCCP إلى الخلايا التي تتنفس في الحالة الثالثة. أضف ببطء 20 microliters من محلول JC one بتركيز 0.5 millimolar إلى كل طبق زراعة RPTC، وقم بتحريك الأطباق لخلط الصبغة جيداً. ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، ضع المزارع على الثلج وأجرِ غسلتين بمحلول PBS بارد جداً. ثم قم بحصد الخلايا. انقل خلايا RPT إلى أنبوب إبيندورف وقم بتفكيك الطبقات أحادية الخلايا إلى معلق خلوي مفرد عن طريق السحب والضخ بالماصة.

قم بتحليل الفلورة باستخدام قياس التدفق الخلوي عن طريق الاستثارة بواسطة ليزر أيون الأرجون بطول موجي 488 نانومتر. ثم احسب الجهد الغشائي الميتوكوندري للميتوكوندريا المعزولة. يسهل ذلك تقييم سلامة السلسلة التنفسية.

بعد غسل طبقات RPTC أحادية الخلية مرتين باستخدام محلول PBS المنظم البارد جداً، يتم جمع الخلايا وترسيبها عن طريق الطرد المركزي. اغسل الراسب مرة واحدة في 1 mL من المحلول المنظم A، ثم قم بتجانس الخلايا باستخدام مجانس Down حتى تتكسر معظم الخلايا في المتجانس عند فحصها تحت المجهر. بعد ذلك، قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة.

قم بترسيب المتقدرات الخام من السائل الطافي عند 15,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم قم بغسل المتقدرات المترسبة ثلاث مرات باستخدام المنظم c. أعد تعليق كتلة المتقدرات المترسبة في 50 إلى 100 µL من منظم المقايسة وجمّدها في النيتروجين السائل لقياس نشاط NADH ubiquinone oxid reductase. أضف 500 µL من منظم المقايسة مع الإضافات والمتقدرات، مع تضمين عينة ضابطة (blank) تحتوي على جميع الإضافات ولكن بدون المتقدرات. قم بموازنة اللوح عند درجة حرارة 30 °C مع الخلط لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، ضع الطبق في جهاز القياس الطيفي وأضف 10 µL من اليوبيكوينون بتركيز 3.25 mM لبدء التفاعل في كل بئر. سجل الامتصاصية عند 340 nm لمدة ثلاث دقائق بفواصل زمنية قدرها 22 ثانية. وفي مقايسة مماثلة، قم بقياس نشاط سيتوكروم C أوكسيداز باستخدام سيتوكروم C المختزل كركيزة لتفاعل ATP synthase.

قم بتحضير المخاليط الخاصة بفحص نشاط APAs الكلي ونشاط APAs غير الحساس للأوليغوميسين لكل مجموعة علاجية. قم بحضن العينات في خليط التفاعل عند 31 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ابدأ التفاعل بإضافة ركيزة TP وحضنها عند 31 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

انقل 200 µL من خليط الحضن إلى أنبوب يحتوي على 50 µL من TCA بتركيز 3 M، وقم بترسيب البروتينات على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم قم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، املأ طبقاً بـ 96 بئراً بـ 50 µL من كل معيار فوسفات و 50 µL من السائل الطافي لكل عينة في مكررات ثنائية.

ثم أضف 250 µL من كاشف Sumner إلى كل بئر واحضنه عند 30 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، سجل الامتصاصية عند 595 nm. اغسل طبقات RPTC أحادية الخلايا مرتين باستخدام محلول PBS المنظم المبرد بالثلج.

احصد الخلايا في 1 ml من PBS وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب إبيدور. قم بترسيب عينات RPTC عن طريق الطرد المركزي وحدد محتوى ATP باستخدام طريقة اللوسيفيريز الخاصة بطقم تحليل التألق الحيوي لـ ATP. ولتحليل حيوية الخلايا في أطباق قطرها 35 mm، استخدم خمس طبقات أحادية من RPTC لثلاث مجموعات علاج ضابطة من الخلايا: خلايا موجبة للنخر، وخلايا موجبة للموت الخلوي المبرمج، وضابطة بدون صبغة لطبقين.

أضف 2 µL من cisplatin بتركيز 50 mM إلى المجموعة الثانية. أضف 2 µL من tert butyl hydroperoxide بتركيز 500 mM. بعد صبغ الخلايا باستخدام propidium iodide كما هو مفصل في النص المصاحب، اغسل الطبقات أحادية الخلايا باستخدام محلول الربط (binding buffer).

بعد ذلك، قم بصبغ الخلايا باستخدام ANNEXIN five المقترن بـ ZI كما هو مفصل في البروتوكول النصي. ثم قم بحصاد الخلايا برفق وتعليقها في 500 microliters من محلول الربط المنظم، وذلك باستخدام مساحة مطاطية (rubber policeman).

استخدم ماصة لتفريق الخلايا إلى معلق خلوي أحادي، ثم انقل المعلق الخلوي إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي. قم بتفريق الخلايا إلى معلق خلوي أحادي. انتقل فوراً لتقدير كمية الفلورة لـ PI و FE عن طريق قياس التدفق الخلوي؛ حيث يؤدي التوصيل الغدي لـ CD NA الذي يغلف الطفرات النشطة بنيوياً وغير النشطة لبروتين kinase C epsilon إلى زيادة مستويات بروتين kinase C epsilon بشكل ملحوظ في RPTC وفي الميتوكوندريا.

كما كان متوقعاً، يتم فسفرة الشكل النشط بنيوياً للإنزيم في خلايا RP tcs، بينما لا يتم فسفرة الإنزيم السلبي السائد. ويؤدي وجود بروتين كيناز C إبسيلون النشط إلى خفض التنفس الميتوكوندري في خلايا RPTC بغض النظر عن الركيزة المستخدمة لتنشيط الميتوكوندريا. أما بروتين كيناز C إبسيلون غير النشط، فلا يكون له أي تأثير على التنفس الميتوكوندري.

ومن المثير للاهتمام أن تنشيط البروتين كيناز C إبسيلون في RP TCS يقلل من نشاط المعقدات واحد في أربعة. ويرتبط هذا الانخفاض في تنفس RPTC بزيادات في جهد الغشاء الميتوكوندري. ولا يؤدي الطفرة السلبية السائدة إلى مثل هذا التأثير.

كما تصاحب هذه التغييرات انخفاضات في نشاط سينثيز ATP في الميتوكوندريا المعزولة من خلايا RPTC التي تعبر بشكل زائد عن بروتين كيناز C إبسيلون النشط. ونتيجة لذلك، ينخفض محتوى ATP في خلايا RPTC التي تعبر بشكل زائد عن بروتين كيناز C إبسيلون النشط؛ حيث يؤدي التنشيط المستمر لبروتين كيناز C إبسيلون إلى تأثيرات عميقة على شكل الميتوكوندريا، كما يتضح من تجزؤ الميتوكوندريا.

تفعيل بروتين كيناز سي، وليس تثبيطه، يؤدي أيضاً إلى تغيرات في مورفولوجيا الخلايا النبيبية القريبة (RPTC)، مما يتسبب في انكماش الخلايا واستطالة الخلايا الناجية. كما ارتبطت هذه التأثيرات الميتوكوندريا الناتجة عن الإفراط في التعبير عن بروتين كيناز سي إبسيلون النشط في الخلايا النبيبية القريبة (RPCs) بموت الخلايا عن طريق كل من التنخر والاستماتة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير المفرط عن البروتينات في المزارع الأولية باستخدام تقنية الفيروسات الغدية وكيفية تقييم القدرة الميتوكوندرية لتخليق TP. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وكإجراء وقائي، لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات الغدية ينطوي على مخاطر، لذا اتخذ الاحتياطات المناسبة.