رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة تقسيم الجينومات الفيروسية في الخلايا التي تمر بعملية الانقسام. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء بلازميد يمكن رؤيته باستخدام المجهر الفلوري. هنا، يتم هندسة بلازميد ليشمل تكرارات ترادفية لتسلسل مشغل اللاكتوز أو LAC O. وتتمثل الخطوة الثانية في إدخال البلازميد إلى الخلايا المنقسمة، يليه إصابة الخلايا بفيروس قهقري يشفر كابت اللاكتوز أو lac I المدمج مع بروتين فلوري.

سترتبط بروتينات الاندماج الكابحة للاكتوز بشكل محدد بتسلسلات مشغل اللاكتوز في البلازميد sub. وتتم مراقبة الخلايا بواسطة المجهر الفلوري لتتبع البلازميدات الفردية عبر دورات خلوية متعددة. وفي النهاية، تتم معالجة الصور المكتسبة لتحديد كيفية الحفاظ على الجينومات الفيروسية في الخلايا المنقسمة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) أو لطخة ساوثرن (Southern blotting) أو التهجين الموضعي المتألق (fluorescence in situ hybridization)، في أنها تتيح مراقبة البلازميدات الفردية في نقاط زمنية متعددة. ولتمكين رؤية البلازميد عبر المجهر الفلوري، تُستخدم تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية لإدخال قطعة DNA تحتوي على 250 نسخة تقريباً من تسلسل مشغل اللاكتوز أو LAC O في البلازميد. وفي هذا المثال، البلازميد عبارة عن BACMID يبلغ حجمه 170 kilobase pairs تقريباً، يحتوي على الجينوم الكامل لفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوزي أو KSHV ويشفّر مقاومة الـ hygromycin.

أدخل الـ LAC O الذي يحتوي على DNA البلازميد في خلايا الثدييات hela و SLK عن طريق التعداء (transfection). في أطباق قطرها 60 millimeter، قم بتحضين الخلايا مع 10 micrograms من DNA البلازميد المنقى، و25 microliters من lipectomy 2000، و0.5 milliliters من Optum، و3.5 milliliters من DMEM لمدة أربع ساعات. استبدل الوسط بوسط DMEM يحتوي على 10% fetal bovine serum واترك الخلايا لتتعافى لمدة 48 hours.

بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا المنقولة بكثافة منخفضة في أطباق كبيرة وتنميتها لمدة ثلاثة أسابيع في وسط DMEM مع 10% fetal bovine serum و 300 micrograms per milliliter من hygromycin لاختيار البلازميد المُدخل، مع استخدام قطع من trips معقمة وورق ترشيح مبلل لنقل المستعمرات المقاومة لـ hygromycin إلى أطباق استزراع جديدة. تُوضع الأطباق في الحاضنة وبعد مرور أسبوع إلى أسبوعين، عندما تنمو المستنسخات المنقولة لتملأ الطبق، يتم عزل DNA لإجراء الهضم التقييدي و southern blotting للتأكد من أن بوليمر بلازميد LAC O متجانس وبالحجم المتوقع. تُظهر هذه اللطخة النموذجية أن بوليمر LAC O في المستنسخ الأول متجانس ومطابق لذلك الموجود في الضابط الموجب.

في المسار السابع، إذا لم يتم هندسة البلازميد للتعبير عن اندماج لكابح اللاكتوز lacI، قم بإصابة النسائل المناسبة بفيروس قهقري يشفر lacI المدمج مع بروتين فلوري أحمر مثل tdTomato؛ وقد تم اختيار tdTomato بدلاً من البروتينات التي تتفلور بلون أقرب إلى الأخضر لتقليل السمية الضوئية التي قد تحدث نتيجة التعرض المتعدد لفترات طويلة. وبمجرد إدخال بروتين اندماج lacI، يتم استزراع الخلايا في وجود 200 µg/mL من IPTG لمنع بروتينات الاندماج من الارتباط بالـ DNA. ويعد الحصول على نسائل ذات شدة فلورية مناسبة أحد أكثر الجوانب حرجاً في هذا الإجراء.

يجب فحص عدد كبير من المستعمرات لتحديد تلك التي تتميز بفلورة مثالية. تُزرع الخلايا لمدة ثلاثة أيام على الأقل للسماح بتعبير بروتين LAC eye TD tomato، ثم تُفحص المستعمرات لتحديد تلك التي تحتوي على مستويات مثالية من lac eye, TD tomato والتي تُظهر إشارات متميزة مع أدنى مستويات خلفية من بروتين الاندماج غير المرتبط. قبل 24 إلى 48 ساعة من التصوير، تُوضع الخلايا المعبرة عن LAC I TD tomato في طبق زجاجي القاع بقطر 35 مليمتر بكثافة تقل عن 10% confluence. سيسمح ذلك لأزواج الخلايا بالانقسام إلى مستعمرات تتكون من 8 إلى 16 خلية دون تداخل، وذلك قبل ساعة إلى ثلاث ساعات من بدء التصوير.

اشطف الطبق ثلاث مرات باستخدام وسط زراعي يخلو من كل من الأدوية الانتقائية وIPTG. تعمل هذه الخطوة على غسل الخلايا غير القابلة للحياة وتسمح لبروتينات دمج lac eye بالارتباط بـ LAC cytes في البلازميدات. استبدل الوسط الزراعي بـ 2 mL من DMEM المحتوي على 10% fetal bovine serum و25 mM Hippies، ثم حضن العينة لمدة تتراوح من ساعة إلى ثلاث ساعات. قبل التصوير مباشرةً، استبدل الغطاء العلوي لطبق الزراعة بورق القصدير الممتد في حلقة تثبيت لطبق مقاس 35 mm.

سيعمل هذا الغطاء على منع تبخر وسط الزرع، وهو الأمر الذي قد يؤدي إلى زيادة تركيز الأملاح بمرور الوقت وموت الخلايا. يتكون نظام التصوير المستخدم في هذه التجربة من مجهر مقلوب من طراز Zeiss Axio 200 M، مجهز بمسرح آلي وكاميرا EM CCD للكشف الحساس عن الإشارات. ويتم توفير ضوء الإثارة الفلوري بواسطة مصباح LED أبيض محايد من نظام Collibra.

يتم التحكم في نظام التصوير بواسطة برنامج مخصص للاستحواذ الآلي على الصور عبر فترات زمنية طويلة مع مجموعات متعددة من المقاطع العرضية (Z stacks). وتُستخدم حاضنة مثبتة فوق المنصة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، وتركيز 5 إلى 10% من ثاني أكسيد الكربون في غرفة مرطبة. استخدم طوقاً مسخناً للعدسة الشيئية الزيتية لمنع حدوث عملية السحب (siphoning) في العدسة.

قم بتسخين العينة مع إعطاء وقت كافٍ للنظام حتى يصل إلى درجة حرارة مستقرة. وللحد من تشوهات الحركة أثناء التجربة، يجب وضع نظام التصوير على طاولة هوائية لعزله عن الاهتزازات. لبدء إجراء تصور الحمض النووي DNA المسمى، استخدم تصوير DIC لعرض الخلايا وتحديد المستوى البؤري للجزء العلوي والسفلي من الخلايا في مجالات رؤية متعددة؛ وفي كل مجال، انتقل إلى مستوى بؤري يبعد تقريبًا ثلث المسافة من أعلى الخلية، ثم احفظ إحداثيات x وy وZ في قائمة مواضع المنصة المحفوظة.

سيكون كل موضع من هذه المواضع المحفوظة مركزاً لسلسلة Z-stack من الصور لالتقاط الخلية في برنامج التحكم بالمجهر، وقم بتحديد سلسلة Z-stack من الصور ليتم تنفيذها عند كل موضع مرحلي محفوظ، وحدد عدداً كافياً من الشرائح بحيث يتم التقاط الخلية بأكملها مع شرائح إضافية فوق وتحت المستويات التي تقع فيها الخلايا. اختر حجم خطوة Z يتراوح بين 0.35 إلى 0.50 microns للسماح بتقريب أخذ العينات وفق معيار Nyquist في البعد Z. وتسمح هذه الشرائح بالكشف عن حركات الخلايا أثناء الدورة الخلوية، كما تُستخدم أيضاً في معالجة حزم الصور بعد عملية الالتقاط.

سيؤدي ذلك إلى الحصول على مجموعة مكونة من 40 إلى 60 صورة اعتماداً على سمك الخلايا. حدد تجربة سلسلة زمنية لجمع صورة بالمجال المضيء لـ Zacks كل 30 دقيقة وصور فلورية بفواصل زمنية تتراوح من 10 إلى 60 دقيقة. لا تستخدم التصوير بتباين التداخل التفاضلي (DIC) أثناء التجربة لأنه يتطلب ضوءاً أكثر من التصوير القياسي بالمجال المضيء، مما قد يعرض الخلايا للتسمم الضوئي بشكل غير ضروري على مدار التجارب الطويلة.

ابدأ التجربة التي يتم التحكم فيها بواسطة البرنامج. تأكد من عدم تعريض النظام لأي تشويش أثناء التجربة. بعد الحصول على جميع الصور الخاصة بالتجربة، راجع الصور لكل Zack ونقطة زمنية، ثم قم بقص أي مناطق غير ضرورية من الصور لتقليل وقت معالجة الكمبيوتر.

في الخطوة التالية، يتم إعادة تعيين شدة الإشارة إلى بكسل الأصل في كل مكدس Z. استخدم خوارزمية إزالة الالتفاف (deconvolution) في برنامج Axio vision استناداً إلى دالة انتشار النقطة (point spread function) المقاسة لنظام التصوير. تظهر نتيجة عملية إزالة الالتفاف هنا.

افحص الصور لتتبع تغيرات الشدة وحركات البلازميدات خلال الدورة الخلية وتوزع البلازميدات على الخلايا الوليدة. تُظهر هذه الصور، التي تم إنشاؤها حاسوبياً لتشمل مستويات Z متعددة تقع فيها الإشارات المختلفة، أن نوى خلايا HELOC التي تعبر عن LAC eye TD tomato تكون فلورية بسبب إشارة التموضع النووي الموجودة على البروتين المدمج، مما يعمل على توطينه في النواة. وفي حالة غياب I-P-T-G-K-S-H-V، تقوم الجينومات التي تشفر تسلسلات LAC O بجذب نسخ عديدة من البروتين الفلوري وتظهر كإشارات ساطعة فوق شدة خلفية النواة.

على النقيض من ذلك، عند وجود IPTG، يتم منع البروتينات الفلورية LAC eye من الارتباط بتسلسل التعرف lack O الخاص بها. وتُظهر هذه الصورة مساقط الكثافة القصوى لـ Zack التي تم الحصول عليها لخلية واحدة في خمس نقاط زمنية من الدورة الخلوية في تجربة نموذجية. يتم تخليق الجينومات الفيروسية المحددة فلورياً في الخلية المرئية في اللوحة A كما هو موضح في اللوحة B. ثم يتم تقسيم الجينومات الفيروسية على الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية كما هو ملاحظ في اللوحات C وD وE. تستغرق الدورة الخلوية لخلايا HELOC السليمة حوالي 24 ساعة، وعادة ما تلتصق الخلايا الوليدة بالقرب من بعضها البعض وتستمر في الانقسام في الوقت نفسه في الدورة الخلوية التالية.

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تتبع الجينومات الفيروسية داخل الخلية لعدة أجيال. ومن المهم عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء مراقبة مورفولوجيا الخلايا أثناء وقت التوليد لضمان سلامة الخلايا طوال فترة التجربة.