بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة المتصورة المنجلية بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد
May 16th, 2013
هذا الأسلوب يحقق في النمط الظاهري تكتل الصفائح الدموية بوساطة المتصورة المنجلية الكريات الحمراء المصابة (pRBC) في العزلات السريرية. يتم تنفيذ ذلك عن طريق عزل وشارك في احتضان البلازما الغنية الصفيحات وتعليق pRBC.
يقدم هذا الإجراء بعض الإرشادات الموحدة لإجراء فحوصات التكتل بوساطة الصفائح الدموية لعزلات باريم الكاذبة السريرية أو المختبرية. أولا ، جمع الدم من مريض مصاب وحصاد كريات الدم الحمراء المتطفلة عن طريق الطرد المركزي ، ثم استزراع وتنقية مراحل النضج اللاجنسي. بعد ذلك ، جمع الدم من متبرع سليم من أجل تحضير وتوحيد البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي.
امزج كل من الصفائح الدموية وكريات الدم الحمراء المتطفلة لمقايسة التكتل. لنفترض أن نتائج الفحص المجهري المناعي يمكن أن تظهر كتل الفوسيرة فال بيروم بوساطة الصفائح الدموية. تم تصميم هذه التقنية خصيصا لقياس النمط الظاهري المتكتل للمتصورة sra.العزلات
السريرية في بيئة فقيرة الموارد. وبحسب ما ورد كان الحد الأدنى من الاختلافات في الإجراءات لزيادة التأثير في نتيجة تكتل الحمض في الميدان. لذلك كانت هناك حاجة إلى بروتوكول واضح وسهل المتابعة يتكيف مع إعدادات الموارد المنخفضة للتوحيد عبر المواقع الحقلية المتوطنة للملاريا في سترات الصوديوم ، يجمع الفراغ ما يقرب من خمسة ملليلتر من الدم الكامل من مضيف ساذج للملاريا أو 2.5 ملليلتر من الدم من مرضى الملاريا CM أو SM.
قم بالطرد المركزي للدم كله عند 250 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل المادة الطافية الغائمة بعناية إلى أنبوب نظيف سعة 15 مل. تذكر أن الصفائح الدموية يتم تنشيطها بسهولة عن طريق درجة الحرارة والاختلافات والصدمات الجسدية.
تعداد تعليق البلازما الغنية بالصفائح الدموية باستخدام مزعج bower ، مقياس الخلوي الدموي واضبط التركيز المطلوب باستخدام PBS للحصول على حبيبات البلازما الفقيرة الصفائح الدموية ، غالبية الصفائح الدموية من جزء من جزء البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي عند 1500 GS لمدة 10 دقائق. قم بتخزين كسور PRP و PPP عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثمانية إلى 10 أيام. من الناحية المثالية استخدام الصفائح الدموية الطازجة لفحص التكتل.
اغسل خلايا الدم الحمراء المحيطية المحببة ثلاث مرات بخمسة إلى 10 ملليلتر من RPMI 1640 في قارورة مزرعة مكمل PRBC مع مزرعة الملاريا القياسية ، وخلايا الدم الحمراء المتوسطة والطازجة غير المصابة لتحقيق 5٪ هيماتوكريت. تخلل قوارير الثقافة بمزيج من 92.5٪ نيتروجين و 2.5٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم ختم واستزراع الطفيليات الناضجة من ثنائي الفينيل متعدد الكلور للمريض.
احتضان قارورة الاستزراع لمدة 24 إلى 36 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع ما يقرب من 10 إلى 15 ميكرولترا من الدم على أحد طرفي شريحة زجاجية بلورية تستقر على سطح مستو. المس قطرة الدم بحافة الشريحة الثانية حتى ينتشر الدم بالتساوي عبر حافة الشريحة الثانية مع الضغط على الشريحة الثانية بزاوية 45 درجة.
بسرعة ولكن بلطف دون ممارسة الكثير من الضغط على الشريحة الأولى ، وزع الدم بالتساوي عبر الشريحة الأولى. ثم جفف الطبقة الرقيقة من الدم في الهواء ، وقم بتجفيف منطقة العينة بالميثانول لمدة 10 ثوان. ثم يجف في الهواء بعد ذلك ، اغمر العينة بنسبة 2٪ keem.
استمر لمدة 10 دقائق على الأقل. اشطفها على نطاق واسع حتى يصبح الماء صافيا ويجف في الهواء. افحص العينات تحت عدسة مستحلب زيت 100 × على مجهر ضوئي.
بعد ذلك ، قم بتنقية ومزامنة PFS parum الناضج ، PRBC كما هو موضح في بروتوكول النص. جميعها تنقل الثقافة إلى أنبوب نظيف ومعقم سعة 15 مل. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 370 GS لمدة خمس دقائق.
الآن قم بشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. ثم أعد تعليق الخلايا بحيث يكون نصف الحجم الكلي عبارة عن صهر جيلو. ثلث النصف الثاني عبارة عن وسيط خال من البروتين وثلثي النصف الثاني عبارة عن ثنائي الفينيل متعدد الكلور
.انقل المعلق إلى أنبوب معقم سعة 15 مليلتر واحتضانه لمدة 15 إلى 20 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى يتشكل ترسيم واضح بين المستويين العلوي والسفلي. انقل الطبقة العليا بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 مليلتر وأضف 10 مل من أجهزة الطرد المركزي RPMI الطازجة عند 370 إلى 430 GS لمدة خمس دقائق. ثم تخلص بعناية من المادة الطافية
الآن قم بتقييم مرحلة التحليل والنمو عن طريق مسحة الدم الرقيقة وفحصها تحت المجهر الضوئي كما هو موضح سابقا. اضبط تعليق كرات الدم الحمراء P الذي تم الحصول عليه بعد تعويم هلام البلازما إلى واحد في 10 إلى ثامن كرات الدم الحمراء الفوسفورية لكل ميكرولتر في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. نقوم بتعليق pbcs عند 5٪ هيماتوكريت أو برتقال أو بروميد أثيريوم عند 20 ميكروغرام لكل مليلتر ، والتركيز النهائي والبلازما الغنية بالصفائح الدموية بنسبة 10٪ من الحجم الإجمالي.
وبالمثل ، قم بإعداد الضوابط التالية لخلايا الدم الحمراء غير المصابة و PRP و PRBC مع PPP للتأكد من دور الصفائح الدموية في تكتل PBC. الآن انقل التعليق إلى قارورة غطاء لولبي ملليلتر. ضع القارورة تحت تحريض لطيف عن طريق اللف عند 10 إلى 12 سعر التجزئة الموصى به في درجة حرارة الغرفة أخذ العينات على فترات من 15 إلى 20 دقيقة لمدة 120 دقيقة لما مجموعه 120 دقيقة للتحقق من تكوين التكتل.
ماصة 10 ميكرولتر من العينة على شريحة زجاجية ومغطاة بزلة زجاجية لفحصها تحت التألق ، تعتبر الكتلة عبارة عن مجموعة من ثلاثة أو أكثر من كريات الدم الحمراء المصابة. قامت هذه التجربة بفحص ما يقرب من 70٪ من المراحل الناضجة من p FALs parem بعد التخصيب بواسطة كتل تعويم هلام البلازما يمكن رصدها بسهولة تحت المجهر كما هو الحال في ظل الضوء العادي. تظهر على شكل مجاميع خلوية وتحت التألق كبقع خضراء أو حمراء.
عندما تلطخ ببروميد الأثيريوم والبرتقالي أو الأثيريوم يموت على التوالي. يزداد حجم الكتلة بشكل كبير إلى متوسط أكبر من 15 ثنائي الفينيل متعدد الكلور لكل كتلة بعد الحضانة لمدة 120 دقيقة مع بعض الكتل التي تحتوي على العديد من pbcs لكل كتلة لا يمكن حسابها بصريا. يتم حساب تكرار النمط الظاهري المتكتل على أنه عدد الخلايا المصابة الموجودة في كتل لكل 1000 خلية مصابة يتم احتسابها في فحوصات مكررة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم واضح لكيفية إجراء فحص التكتل المتصورة المنجلية ، بوساطة الصفائح الدموية. احرص على عدم تنشيط الصفائح الدموية بحركات متشنجة وتغيرات في درجات الحرارة. يمكن أيضا تطبيق هذا الاختبار لقياس مقايسة التكتل بوساطة الصفائح الدموية في الملاريا الحادة.
نظرة عامة
تبحث هذه الطريقة في ظاهرة التكتلات التي تتوسطها الصفائح الدموية للخلايا الحمراء المصابة بطفيلي البلاستموديوم فالسيباروم في العزلات السريرية. تتضمن الإجراء عزل البلازما الغنية بالصفائح الدموية وشرائها المشترك مع تعليق من الخلايا الحمراء المتطفلة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الدقيقة
- البحث السريري
الخلفية
- التكتلات التي تتوسطها الصفائح الدموية هي ظاهرة مهمة في علم أمراض الملاريا.
- فهم هذه التكتلات يمكن أن يساعد في تقييم شدة الملاريا.
- الطرق المعيارية ضرورية لإمكانية التكرار في البحث.
- تركز هذه الدراسة على العزلات السريرية في البيئات منخفضة الموارد.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول موحد لاختبارات التكتلات التي تتوسطها الصفائح الدموية.
- لقياس ظاهرة التكتلات للبلاستموديوم فالسيباروم.
- لتسهيل البحث في المناطق الموبوءة بالملاريا.
الطرق المستخدمة
- جمع الدم من المرضى المصابين والمتبرعين الأصحاء.
- الطرد المركزي لعزل الخلايا الحمراء المتطفلة وتحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية.
- الشروع المشترك للصفائح الدموية مع الخلايا الحمراء المتطفلة.
- تقييم التكتلات باستخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري.
النتائج الرئيسية
- تم قياس ظاهرة التكتلات بنجاح في العزلات السريرية.
- تم تحديد شروط تنشيط الصفائح الدموية لتقليل التباين.
- أظهرت النتائج تشكل تكتلات كبيرة بعد الحضانة.
- زاد حجم التكتلات بشكل ملحوظ مع مرور الوقت، مما يشير إلى التكتلات النشطة.
الخلاصات
- يوفر الاختبار طريقة موثوقة لدراسة علم أمراض الملاريا.
- التوحيد أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج متسقة عبر الإعدادات المختلفة.
- يمكن تكييف هذه الطريقة للاستخدام في البيئات منخفضة الموارد.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes provides a measurable phenotype linked to malaria severity in endemic populations. Standardizing this assay enables consistent evaluation of parasite adhesion mechanisms across resource-limited field sites. This supports target validation and mechanistic de-risking in antimalarial therapeutic development by linking in vitro phenotypes to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-parasite adhesion pathways involving CD36 and gC1qR/HABP1/p32 receptors.
- Operational Value: Provides a standardized method to assess clumping phenotype in clinical isolates without cryopreservation.
- Predictive Value: Links in vitro clumping frequency to disease severity in patient populations, supporting biomarker association studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses platelet-rich plasma and purified parasitized erythrocytes to generate quantitative clumping readouts.
- Reproducibility: Defines centrifugation, incubation, and sampling intervals to minimize variability in low-resource settings.
- Scalability: Requires minimal equipment (centrifuge, microscope) enabling deployment across malaria-endemic field sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects platelet-mediated clumping to severe malaria phenotypes observed in pediatric cerebral malaria cases.
- Translational Continuity: Allows progression from field isolate testing to mechanistic studies of adhesion receptor inhibition.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of compounds or antibodies that disrupt platelet-mediated clumping in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the malaria discovery continuum from early target validation to preclinical evaluation of adhesion-blocking interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite ligand-receptor interactions involved in sequestration and microvascular pathology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (clump frequency and size) for evaluating compound effects on platelet-mediated aggregation.
- Analytics: Generates measurable endpoints—clump frequency per 1000 infected cells and average clump size—enabling comparison across isolates and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro phenotyping with ex vivo clinical correlations from severe malaria patient cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing adhesion phenotypes across diverse Plasmodium falciparum strains and geographic isolates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in parasite sequestration by quantifying a receptor-mediated adhesion phenotype.
- Operational Value: Ensures standardization through defined platelet preparation, parasite enrichment, and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimalarial programs by identifying compounds that inhibit pathogenic adhesion mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro clumping inhibition to potential reduction in severe malaria outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasitology, blood handling, and microscopy for accurate isolate preparation and clump detection.
- Dependent on centrifuge access for platelet-rich plasma preparation and parasitized erythrocyte purification.
- Necessitates standardization of agitation speed (10–12 rpm) and sampling intervals (15–20 min) across sites to ensure reproducibility.
- Must account for platelet sensitivity to temperature shifts and mechanical stress during isolation and assay setup.
- Limited to qualitative and semi-quantitative readouts unless paired with automated imaging or flow cytometry for high-throughput adaptation.
