بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة المتصورة المنجلية بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

يوفر هذا الإجراء بعض الإرشادات الموحدة لإجراء اختبارات التكتل التي تتوسطها الصفائح الدموية لعزلات *Plasmodium falciparum* السريرية أو المختبرية. أولاً، يتم جمع الدم من مريض مصاب وحصاد الكريات الحمراء المصابة بالطفيليات عن طريق الطرد المركزي، ثم استزراع وتنقية المراحل الناضجة اللاجنسية. بعد ذلك، يتم جمع الدم من متبرع سليم من أجل تحضير وتوحيد البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي.

اجمع بين كل من الصفائح الدموية والكرات الحمراء المصابة بالطفيليات لإجراء مقايسة التكتل. يمكن أن تظهر نتائج المجهر الفلوري المناعي تكتلات P Fal sperum بوساطة الصفائح الدموية. صُممت هذه التقنية خصيصاً لقياس النمط الظاهري للتكتل في plasmodium sra.

عزلات سريرية في بيئة محدودة الموارد. أُفيد بأن التباينات الطفيفة في الإجراءات قد تزيد من التأثير على نتيجة اختبار التكتل الحمضي في الميدان. وبناءً على ذلك، كانت هناك حاجة إلى بروتوكول واضح وسهل المتابعة ومكيف مع البيئات ذات الموارد المحدودة لتوحيد المعايير عبر المواقع الميدانية الموبوءة بالملاريا. في أنبوب vacutainer يحتوي على سترات الصوديوم، يتم جمع 5 مل تقريبًا من الدم الكامل من مضيف غير مصاب بالملاريا، أو 2.5 مل من دم المرضى المصابين بالملاريا الدماغية (CM) أو الملاريا الشديدة (SM).

قم بطرد الدم الكامل مركزياً بقوة 250 Gs لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل المادة الطافية العكرة بعناية إلى أنبوب نظيف سعة 15 milliliter. تذكر أن الصفائح الدموية تنشط بسهولة بفعل التغيرات في درجات الحرارة والصدمات الفيزيائية.

قم بتعداد معلق PRP باستخدام غرفة عد كريات الدم (hemocytometer) وضبطه للتركيز المطلوب باستخدام PBS للحصول على راسب بلازما فقيرة بالصفائح الدموية، حيث يتم فصل غالبية الصفائح الدموية من جزء من كسر PRP عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1500 GS لمدة 10 دقائق. تُخزن كسور PRP وPPP عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 8 إلى 10 أيام. ويُفضل استخدام صفائح دموية حديثة في مقايسة التكتل.

اغسل خلايا الدم الحمراء الطرفية المترسبة ثلاث مرات باستخدام خمسة إلى 10 milliliters من RPMI 1640 في دورق استنبات. قم بتكملة خلايا الدم الحمراء الطرفية (PRBC) باستخدام وسط استنبات الملاريا القياسي وخلايا دم حمراء جديدة غير مصابة لتحقيق نسبة هيماتوكريت 5%. قم بتنفيس دورق الاستنبات بخليط مكون من 92.5% nitrogen و 2.5% oxygen و 5% carbon dioxide. ثم أغلق الدورق بإحكام واستنبت الطفيليات الناضجة من خلايا الدم الطرفية للمريض.

يُحضن دورق المزرعة لمدة تتراوح من 24 إلى 36 ساعة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C وبتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون. ضعي حوالي 10 إلى 15 µL من الدم على أحد طرفي شريحة زجاجية مغشاة موضوعة على سطح مستوٍ. المسى قطرة الدم بحافة شريحة ثانية مع إمالة الشريحة الثانية بزاوية 45 درجة، حتى يمتد الدم بالتساوي على طول حافة الشريحة الثانية.

قم بتوزيع الدم بالتساوي وبسرعة ولكن برفق على الشريحة الأولى دون الضغط عليها بشدة. ثم اترك طبقة الدم الرقيقة تجف في الهواء، وقم بتجفيف منطقة العينة باستخدام الميثانول لمدة 10 ثوانٍ. بعد ذلك، اتركها تجف في الهواء مجدداً، ثم اغمر العينة في محلول 2%keem.

اترك العينة لمدة 10 دقائق على الأقل. اغسلها جيداً حتى يصبح الماء صافياً، ثم اتركها تجف في الهواء. افحص العينات تحت عدسة زيتية بقوة تكبير 100x باستخدام المجهر الضوئي.

بعد ذلك، قم بتنقية ومزامنة خلايا PFS parum الناضجة، PRBC كما هو موضح في البروتوكول النصي. انقل المزرعة بالكامل إلى أنبوب نظيف ومعقم سعة 15 milliliter. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 370 GS لمدة خمس دقائق.

الآن، قم بشفط السائل الطافي بعناية دون تحريك الراسب. ثم أعد تعليق الخلايا بحيث يكون نصف الحجم الإجمالي عبارة عن jello fusing. أما النصف الثاني، فيكون ثلثه وسطاً خالياً من البروتين وثلثاه من pbcs.

انقل المعلق إلى أنبوب معقم سعة 15 مل وحضنه لمدة تتراوح بين 15 إلى 20 دقيقة في حاضنة عند 37 °C حتى يتشكل فصل واضح بين المستويين العلوي والسفلي. انقل الطبقة العليا بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 مل وأضف 10 مل من وسط RPMI الجديد، ثم قم بالطرد المركزي عند 370 إلى 430 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تخلص من supernatant بعناية.

قم الآن بتقييم نسبة الطفيليات والمرحلة التطورية عن طريق مسحة دم رقيقة وفحصها تحت المجهر الضوئي كما تم وصفه سابقاً. قم بتعديل معلق P RBCs الذي تم الحصول عليه بعد تعويم هلام البلازما ليصبح 1 × 10⁸ P RBCs لكل µL في أنبوب جديد سعة 1.5 mL. نقوم بتعليق pbcs عند نسبة هيماتوكريت 5% في صبغة الجينسيا برتقالية (aine orange) أو بروميد الأثيريوم بتركيز نهائي 20 µg/mL و PRP بنسبة 10% من الحجم الكلي.

وبالمثل، قم بتحضير الضوابط التالية: كريات دم حمراء غير مصابة، وPRP وPRBC مع PPP للتأكد من دور الصفائح الدموية في تكتل PBC. والآن، انقل المعلق إلى قارورة ذات غطاء لولبي سعة 2 مل. ضع القارورة تحت تحريك خفيف عن طريق الدوران بسرعة 10 إلى 12 RRP في درجة حرارة الغرفة، مع أخذ عينات على فترات تتراوح بين 15 إلى 20 دقيقة لمدة إجمالية قدرها 120 دقيقة للتحقق من تكوين التكتلات.

قم بسحب 10 µL من العينة ووضعها على شريحة زجاجية ثم غطِّها بغطاء شريحة زجاجية للفحص تحت المجهر الفلوري، ويُعتبر التكتل عبارة عن تجمع لثلاث كريات دم حمراء مصابة أو أكثر. قد اختبرت هذه التجربة ما يقرب من 70% من المراحل الناضجة لـ p FALs parem بعد الإثراء عن طريق تعويم هلام البلازما، ومن السهل رصد التكتلات تحت المجهر كما هو الحال في الضوء العادي؛ حيث تظهر على شكل تجمعات خلوية، وتظهر تحت الفلورة على شكل بقع خضراء أو حمراء.

عند الصبغ بصبغتي acridine orange أو ethidium bromide على التوالي، يزداد حجم التكتلات بشكل ملحوظ ليصل إلى متوسط يزيد عن 15 pbcs لكل تكتل بعد الحضانة لمدة 120 دقيقة، حيث احتوت بعض التكتلات على عدد كبير من pbcs لكل تكتل تعذر عدّها بصرياً. ويتم حساب تكرار النمط الظاهري للتكتل كعدد الخلايا المصابة الموجودة في تكتلات لكل 1000 خلية مصابة تم عدّها في مقايسات مكررة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم واضح لكيفية إجراء اختبار التكتل بوساطة الصفائح الدموية لـ plasmodium falciparum. احرص على عدم تنشيط الصفائح الدموية من خلال الحركات المفاجئة وتغيرات درجات الحرارة. يمكن تطبيق هذا الاختبار أيضًا لقياس اختبار التكتل بوساطة الصفائح الدموية في حالات الملاريا الشديدة.