December 3rd, 2012
الموصوفة هنا هو في الجسم الحي التقنية لهياكل شبه الخلوية الصورة في حيوانات تعرضت لنقص الأكسجين باستخدام تدفق الغاز من خلال غرفة microincubation جنبا إلى جنب مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب واضح ومباشر ومرنة بما يكفي لتناسب مجموعة متنوعة من المعلمات التجريبية ونظم النموذج.
الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تقنية في الجسم الحي لتصوير الديناميكيات تحت الخلوية في أجنة أناقة البحر المعرضة لنقص الأكسجين باستخدام تدفق الغاز من خلال الإعداد على مجهر عالي الطاقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد عينة من المعدلة وراثيا البالغة الصغيرة أولا لتوليد مجموعة مناسبة من الأجنة الصغيرة للتصوير. بعد ذلك ، قم بإعداد شرائح وسادة agros رقيقة لاستخدامها في غرفة الحضانة الصغيرة.
ثم يتم تخدير أناقة البحر بشكل صحيح وتغطيتها بزيت الكربون الهالة لتجنب الجفاف عند التعرض لتدفق الغاز. أخيرا ، يتم وضع زجاج الغطاء الدائري مع المخدرة في غرفة الحضانة الدقيقة. ثم يتم وضع الغرفة على مرحلة المجهر وتعبئتها بغاز النيتروجين لإنتاج بيئة خالية من الأكسجين أثناء تصوير استخدام تدفق الغاز عبر غرفة الحضانة الدقيقة.
بالاقتران مع الفحص المجهري الفلوري في الجسم الحي يسمح بمقاطع فيديو وصور مفصلة عالية الدقة لتوقف دورة الخلية استجابة لنقص الأكسجين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التألق المناعي غير المباشر ، هي أنه يمكن توثيق التغيرات تحت الخلايا في الجسم الحي أثناء تعرض لظروف معينة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للرسوم المتحركة المعلقة الناجمة عن نقص الأكسجين في أجنة الإليجانس.
يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الخميرة أو زراعة الخلايا أو غيرها من أجنة اللافقاريات أو الفقاريات الصغيرة. يمكن أيضا تطبيق شروط إضافية مثل درجة حرارة فرط التأكسج أو الإجهاد أو العلاج بجزيئات صغيرة. إثبات هذا الإجراء هو أناستاسيا جارسيا وماري لات ، وهما طالبان دراسات عليا من مختبري ، ابدأ بسلالة C Elgan المعدلة وراثيا مناسبة ذات أهمية في هذه الدراسة ، سيتم استخدام سلالة TH 32 المعدلة وراثيا لتصور الكروموسومات والجسيمات المركزية كعلامات لانقسام الخلايا.
قم بإنشاء مجموعة متزامنة عن طريق تفكيك البالغين في محلول هيبوكلوريت واستخدام الأجنة المتبقية لالتقاط الجاذبية البالغة على صفيحة مصنفة وبيضة ، أو وضع ساعة إلى ساعتين ، أو قطف L أربعة يرقات من مجموعة مختلطة على صفيحة بذرة جديدة. تنمو الديدان الخيطية عند 20 درجة مئوية إلى GR في مرحلة البلوغ المبكرة ، والتي ستستغرق حوالي 96 ساعة من الفقس ، أو 72 ساعة من L يرقات واحدة ، أو 24 ساعة بعد L أربعة تساقيب. توفر هذه المنهجية وسيلة لتوليد مجموعة من الشباب البالغين الذين يحتوون على عدد وفير من الأجنة الصغيرة ، والتي تحتوي على تجديف كبير ونوى مثالية لتصوير التغيرات في النواة تحت الخلوية والنواة الفرعية.
لإنشاء غرفة رطبة لحمل الشرائح المعدة ، ضع منشفة ورقية مبللة داخل طبق بتري كبير أو صندوق مغطى بغطاء بحجم كاف. تحضير 2٪ aros المنصهر في الماء منزوع الأيونات عن طريق تسخين الخليط في الأواني الزجاجية عبر الميكروويف أو حمام مائي. في المكان التالي ، ضع شريحة إلى ثلاث قطرات من aros الدافئة على مجهر زجاجي نظيف ، ضع على الفور شريحة ثانية مقلوبة بشكل عمودي فوق قطرات aros ، واضغط قليلا حتى تكون الوسادة الناتجة رقيقة وخالية من فقاعات الهواء.
بعد أن يبرد aros ، قم بتفكيك شريحتي المجهر ببطء ، مع ترك وسادة aros سليمة على إحدى الشرائح. من المهم التأكد من أن وسادة aros رقيقة بما يكفي لعدم التداخل مع القدرة على تركيز المجهر. فيما بعد. استخدم شفرة حلاقة نظيفة لتشكيل وسادة Aros في متجر مربع صغير.
ينزلق في الغرفة الرطبة المعدة حتى يصبح جاهزا للاستخدام. باستخدام نفس شفرة الحلاقة النظيفة ، خذ حافة وسادة aros بحذر وانقلها من الشريحة إلى زجاج دائري بغطاء دقيق مقاس 25 ملم. لتجنب تراكم فقاعات الهواء تحت الغطاء الدائري ، يجب أن يتناسب الزجاج بشكل مناسب مع الحاضنة الصغيرة.
أضف قطرة من المخدر إلى وسادة الإيروس. اختر من خمس إلى 10 ديدان وضعها في قطرة التخدير. اترك دقيقة إلى ثلاث دقائق حتى تتوقف الديدان عن الحركة.
باستخدام طرف الماصة ، أضف قطرة من زيت الكربون المقدس فوق الديدان لمنع الديدان من الجفاف أثناء تدفق الغاز عبر الغرفة. بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد طرفي الأنابيب البلاستيكية المرنة بالغرفة. افصل نصفي حاضنة التروية الدقيقة المغلقة وضع زجاج الغطاء بعناية في وضع مستقيم على الحلقة السفلية.
أغلق جانبي الغرفة معا بإحكام. ثم قم بتوصيل الغرفة عبر الأنبوب البلاستيكي المرن بخزان غاز النيتروجين وضعه على مرحلة المجهر. تحقق من وجود أي تسريبات عن طريق ضمان التثبيت الآمن للأنابيب ومقابس المنفذ على طول جانب الغرفة لتصوير الأجنة.
أولا ، حدد موقع بتكبير أقل. ثم انتقل إلى التكبير الأعلى المناسب. لتصوير التجديف الجنيني عند البالغين ، استخدم الليزر 488 نانومتر لتحديد موقع بروتين اندماج GFP في الخلايا ذات الاهتمام.
لتصور مرحلة معينة من توقف دورة الخلية ، على سبيل المثال ، الطور الأولي المتأخر ، حدد التجديف في مرحلة سابقة من انقسام الخلية مثل الطور البيني المتأخر أو الطور الأولي المبكر. قم بتفريخ الغرفة بغاز النيتروجين واستمر في مراقبة المجدفات بينما يملأ النيتروجين الغرفة ، مع ضبط المستوى البؤري حسب الضرورة. قم بإجراء تصوير الفاصل الزمني لالتقاط الظاهرة المرغوبة ذات الاهتمام في هذه الحالة.
توقف الطور الأولي وتثبيت الكروموسومات في الغشاء النووي الداخلي. التقط الصور مرة كل 10 ثوان لمدة تصل إلى 30 دقيقة. عادة ما يحدث توقف الطور الأولي الناجم عن نقص الأكسجين في غضون 20 إلى 30 دقيقة من بدء تدفق غاز النيتروجين.
لتوثيق التعافي من حالة التوقف الناجم عن نقص الأكسجين ، قم بإيقاف تشغيل الغاز والسماح للغرفة بالعودة إلى نورموكسيا أثناء تسجيل سلسلة الفاصل الزمني. عادة ما يحدث استئناف دورة الخلية والتراجع عن الكروموسومات في غضون خمس إلى 20 دقيقة. استخدم صورة erris J أو Photoshop لمعالجة الصور ومقاطع الفيديو واستيرادها إلى QuickTime للعرض.
داخل الجنين المعرض لنقص الأكسجين ، كروموسومات الطور الأولية. سوف يتكثف المجدفون ويتماشى مع المحيط النووي الداخلي. ستستأنف الظاهرة التي يشار إليها باسم رسو الكروموسوم عند إعادة الأكسجين في دورة الخلية وكروموسومات الطور الأولية.
سينتقل التجديف من المحيط النووي إلى الصفيحة الاستوائية مما يشير إلى التقدم إلى الطور. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات باستخدام تم تنظيمها بشكل مناسب. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الشابة البالغة السليمة فقط لتخصيص وقت كاف لإكمال التجربة والتحلي بالصبر عند تعلم اختيار المجدفات التي تم تنظيمها بشكل مناسب.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقاط الأحداث دون الخلوية الناجمة عن نقص الأكسجين في الجسم الحي باستخدام أجنة GaN وتدفق الغاز عبر الغرفة على مجهر عالي الطاقة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
تصف هذه المقالة تقنية in vivo لتصوير ديناميات تحت الخلوية في أجنة sea elegans المعرضة لنقص الأكسجين. تستخدم الطريقة تدفق الغاز عبر غرفة حضانة صغيرة بالاقتران مع مجهر confocal ذو قرص دوار عالي الطاقة.
This technique enables real-time visualization of subcellular dynamics in live embryos under controlled anoxic conditions, providing mechanistic insights into stress-induced cell cycle arrest. By capturing reversible prophase arrest and chromosome docking in C. elegans, it supports target validation in pathways governing suspended animation and metabolic dormancy. The approach offers a disease-relevant system for probing oxygen-sensing mechanisms with predictive confidence in preclinical de-risking.
The method integrates into early discovery workflows by providing live-cell imaging data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead identification.