استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تقنية في الجسم الحي لتصوير الديناميكيات تحت الخلوية في أجنة sea elegance المعرضة لنقص الأكسجين باستخدام نظام تدفق الغاز عبر مجهر عالي القدرة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير عينة من الحيوانات المعدلة وراثياً البالغة لإنتاج مجموعة مناسبة من الأجنة الصغيرة للتصوير. بعد ذلك، يتم تحضير شرائح agros pad الرقيقة لاستخدامها في غرفة الحضن المجهرية.

بعد ذلك، يتم تخدير كائنات sea elegance بشكل مناسب وتغطيتها بزيت الهالوكربون لتجنب الجفاف عند تعرضها لتدفق الغاز. وأخيرًا، توضع شريحة الغطاء الدائرية التي تحتوي على الحيوانات المخدرة داخل غرفة حضانة دقيقة. ثم توضع الغرفة على منصة المجهر وتُملأ بغاز النيتروجين لإيجاد بيئة خالية من الأكسجين أثناء التصوير، وذلك من خلال استخدام تدفق الغاز عبر غرفة الحضانة الدقيقة.

بالاقتران مع المجهر الفلوري الحي (in vivo)، يتيح هذا الإجراء الحصول على صور ومقاطع فيديو تفصيلية عالية الدقة لتوقف الدورة الخلوية استجابةً لنقص الأكسجة (anoxia). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الفلورة المناعية غير المباشرة، في إمكانية توثيق التغيرات تحت الخلوية حيّاً بينما تتعرض الحيوانات لظروف محددة. ومن خلال هذه الطريقة، يمكن اكتساب رؤى حول حالة التعليق الحيوي المستحثة بنقص الأكسجة في أجنة elegans.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى مثل الخميرة، أو المزارع الخلوية، أو أجنة أخرى من اللافقاريات أو الفقاريات الصغيرة. كما يمكن تطبيق ظروف إضافية مثل فرط الأكسجة، أو درجة الحرارة، أو الإجهاد، أو المعالجة بجزيئات صغيرة. ومن يقومان بتوضيح هذا الإجراء هما أناستاسيا غارسيا وماري لات، وهما طالبتان في مرحلة الدراسات العليا من مختبري. ابدأ باستخدام سلالة مناسبة من ديدان C. elegans المعدلة وراثياً ومحل اهتمام الدراسة؛ وفي هذه الدراسة، ستُستخدم السلالة المعدلة وراثياً TH 32 لتصور الكروموسومات والجسيمات المركزية كعلامات لانقسام الخلايا.

قم بتوليد مجتمع متزامن عن طريق تفكيك البالغين من ديدان gravity في محلول الهيبوكلوريت واستخدام الأجنة المتبقية من خلال نقل البالغين من ديدان gravity إلى طبق مستنبت وتركها تضع البيض لمدة ساعة إلى ساعتين، أو بنقل يرقات المرحلة L4 من مجتمع مختلط إلى طبق مستنبت جديد. قم بتربية النيماتودا عند درجة حرارة 20 degrees Celsius حتى تصل إلى مرحلة البلوغ المبكر GR، وهو ما يستغرق حوالي 96 ساعة من الفقس، أو 72 ساعة من يرقات المرحلة L1، أو 24 ساعة بعد انسلاخ المرحلة L4. توفر هذه المنهجية وسيلة لتوليد مجتمع من البالغين الشباب الذين يحتويون على عدد وفير من الأجنة الصغيرة، والتي تتميز بوجود blasts ونوى كبيرة تكون مثالية لتصوير التغيرات تحت الخلوية وتحت النووية.

لإعداد غرفة رطوبة لحفظ الشرائح المجهزة، ضع منشفة ورقية مبللة داخل طبق بتري كبير أو حاوية مغطاة بغطاء ذي حجم مناسب. قم بتحضير 2% aros المصهور في ماء منزوع الأيونات عن طريق تسخين الخليط في أدوات زجاجية باستخدام الميكروويف أو حمام مائي. بعد ذلك، ضع قطرة إلى ثلاث قطرات من aros الدافئ على شريحة مجهرية زجاجية نظيفة، ثم ضع فوراً شريحة ثانية مقلوبة بشكل عمودي فوق قطرات aros، واضغط قليلاً بحيث تكون الطبقة الناتجة رقيقة وخالية من فقاعات الهواء.

بعد تبريد الـ aros ببطء، افصل شريحتَي المجهر، مع ترك وسادة الـ aros سليمة على إحدى الشريحتين. من المهم التأكد من أن وسادة الـ aros رقيقة بما يكفي لضمان عدم تأثيرها على القدرة على ضبط تركيز المجهر. لاحقاً، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لتشكيل وسادة الـ Aros على هيئة مربع صغير.

تُحفظ الشرائح في الغرفة الرطبة المجهزة حتى وقت الاستخدام. وباستخدام نفس شفرة الحلاقة النظيفة، يتم أخذ حافة وسادة الـ aros بعناية ونقلها من الشريحة إلى غطاء زجاجي مجهري مستدير بقطر 25 millimeter. مع تجنب تراكم فقاعات الهواء أسفل الغطاء الزجاجي المستدير، يجب أن يتناسب الغطاء بشكل صحيح مع الحاضنة المجهرية.

أضف قطرة من المخدر على وسادة Aros. اختر من خمس إلى 10 ديدان وضعها في قطرة المخدر. انتظر لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق حتى تتوقف الديدان عن الحركة.

باستخدام رأس ماصة، أضف قطرة من زيت الكربون المجوف فوق الديدان لمنع جفافها أثناء تدفق الغاز عبر الغرفة. بعد ذلك، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب البلاستيكي المرن بالغرفة. افصل نصفي الحاضنة الدقيقة للإرواء المغلقة وضع غطاء الشريحة الزجاجية بعناية وبشكل رأسي على الحلقة السفلية.

أغلق جانبي الغرفة معاً بإحكام. بعد ذلك، قم بتوصيل الغرفة عبر أنابيب بلاستيكية مرنة بخزان غاز النيتروجين وضعها على منصة المجهر. تحقق من عدم وجود أي تسربات من خلال التأكد من التثبيت المحكم للأنابيب وسدادات المنافذ على طول جانب الغرفة لتصوير الأجنة.

أولاً، حدد موقع الحيوانات باستخدام تكبير منخفض. ثم انتقل إلى التكبير العالي المناسب. ولتصوير الأجنة في البالغين، استخدم ليزر بطول موجي 488 nanometer لتحديد موقع بروتين GFP المدمج في الخلايا المستهدفة.

لتصوير مرحلة محددة من توقف الدورة الخلوية، على سبيل المثال، المرحلة التمهيدية المتأخرة، حدد خلية في مرحلة سابقة من انقسام الخلية مثل الطور البيني المتأخر أو المرحلة التمهيدية المبكرة. قم بتدفق غاز النيتروجين في الحجرة واستمر في مراقبة الخلايا بينما يملأ النيتروجين الحجرة، مع ضبط المستوى البؤري حسب الضرورة. أجرِ تصويراً بنظام الفاصل الزمني (time lapse imaging) لالتقاط الظاهرة المطلوبة في هذه الحالة.

توقف الطور التمهيدي وارتباط الكروموسومات بالغشاء النووي الداخلي. التقط صوراً كل 10 ثوانٍ لمدة تصل إلى 30 دقيقة. عادةً ما يحدث التوقف في الطور التمهيدي الناجم عن نقص الأكسجة في غضون 20 إلى 30 دقيقة من بدء تدفق غاز النيتروجين.

لتوثيق التعافي من الحالة المتوقفة الناجمة عن نقص الأكسجين، أغلق صمام الغاز واسمح للغرفة بالعودة إلى حالة الأكسجة الطبيعية مع تسجيل سلسلة من الصور بنظام الفاصل الزمني. عادةً ما يحدث استئناف لدورة الخلية وفك تكثيف الكروموسومات في غضون 5 إلى 20 دقيقة. استخدم برنامج ImageJ أو Photoshop لمعالجة الصور ومقاطع الفيديو، ثم استوردها إلى QuickTime للعرض.

داخل الجنين المعرض لنقص الأكسجين، تتكثف كروموسومات الطور التمهيدي وتصطف مع المحيط النووي الداخلي. تُعرف هذه الظاهرة باسم "رسو الكروموسومات"، وعند إعادة الأكسجة سيتواصل تقدم الدورة الخلوية وكروموسومات الطور التمهيدي.

سينتقل Blasphemy من المحيط النووي إلى الصفيحة الاستوائية، مما يشير إلى التقدم نحو الطور الاستوائي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات باستخدام حيوانات في مراحل نمو مناسبة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام الحيوانات البالغة الشابة والسليمة فقط لتخصيص وقت كافٍ لإتمام التجربة، والتحلي بالصبر عند تعلم كيفية اختيار Blasphemers في مراحل نمو مناسبة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية رصد الأحداث تحت الخلوية الناجمة عن نقص الأكسجين (anoxia) داخل الجسم الحي باستخدام أجنة GaN وغرفة تدفق الغاز على مجهر عالي القدرة.