على في المختبر إعداد والحث على تسجيل البرامج موتور تغذية مع الحركات الفسيولوجية في Aplysia californica

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل النشاط الكهربائي من الأعصاب والعضلات والعصبونات، والحركات المقابلة لجهاز التغذية أثناء برامج الحركة التغذوية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الكتلة البقجية (buccal mass) من حيوان plegia مخدر وتثبيت أقطاب خطافية في الأعصاب والعضلات الرئيسية. الخطوة الثانية هي وضع الكتلة البقجية في طبق تسجيل وتحضير العقد العصبية للتسجيل خارج الخلوي.

بعد ذلك، يتم تحديد موقع العصبونات المستهدفة باستخدام أقطاب كهربائية خارج خلوية. وتتمثل الخطوة النهائية في تحفيز وتسجيل البرامج الحركية للتغذية، مثل العض والبلع والرفض. وفي النهاية، يُستخدم تحضير الكتلة الفموية المعلقة لإظهار نشاط الأعصاب والعضلات والعصبونات الفردية أثناء حركات مختلفة تشبه التغذية للكتلة الفموية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل دراسات العقد العصبية المعزولة، في إمكانية ربط التسجيلات المأخوذة من الأعصاب والعضلات والعصبونات الفردية مباشرة بحركات جهاز التغذية. سيقوم huu، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا، بالمساعدة في توضيح الإجراء. لبدء الإجراء، يتم تخدير سمكة plegia صحية تزن من 200 إلى 300 gram في صينية تشريح عن طريق حقن كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر بتركيز يعادل حوالي 50% من وزن الجسم. بعد الحقنة الأولى بالقرب من ذيل الحيوان، يتم تدليك سطح جسم الحيوان برفق لتوزيع كلوريد المغنيسيوم.

قم بإعطاء حقنات إضافية بالقرب من رأس الحيوان حسب الحاجة. بعد أن يتوقف الحيوان عن الاستجابة للمؤثرات اللمسية اللطيفة، ثبته بالدبابيس على الصينية بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. ضع دبوسًا واحدًا في الذيل ودبوسًا واحدًا في كل مجس أمامي.

بعد ذلك، استخدم الملقط لقرص ورفع جلد الحيوان في منتصف الرأس. خلف "rhino fours"، قم بعمل شق إكليلي عبر رأس الحيوان خلف النقطة الممسكة مباشرة. بعد ذلك، قم بعمل شق سهمي متوسط بين "rhino fours" باتجاه الفم للكشف عن الكتلة الشدقية.

بعد ذلك، اسحب سديلة الجلد بعيداً عن الكتلة الفموية واقطع الأعصاب والأنسجة الضامة التي تربطها بجدار الجسم. ومن أجل فصل سديلة الجلد هذه تماماً عن الكتلة الفموية، تأكد من عدم قطع أي أعصاب أو أنسجة داخلية خاصة بالكتلة الفموية. بعد ذلك، أمسك المريء وثبته.

قم بالقص عبر المريء خلف النقطة التي يتم تثبيتها. اسحب المريء للأعلى وارفع الكتلة البلعومية من خلفها. تشكل العقد الدماغية والبلعومية والقدمية حلقة، حيث تتصل العقدة الدماغية بالعقد البلعومية عبر الموصلات الدماغية البلعومية.

اترك هذه العقد الحلقية متصلة بالكتلة البلعومية واقطع جميع الأعصاب الممتدة من هذه العقد إلى أجزاء الجسم الأخرى. ثم اقطع النسيج الضام المحيط بالكتلة البلعومية واستمر في رفع الكتلة البلعومية للأعلى معما يقل اتصالها بالجسم. وبمجرد أن تصبح الكتلة البلعومية متصلة فقط بالفم، أمسك المريء والكتلة البلعومية.

بشكل مستقيم. قم بإجراء قطع نهائي أمام الفكين مباشرة لتحرير الكتلة الخدية من الجسم. ضع الكتلة الخدية في محلول يتكون من 50% من محلول كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر، و50% من محلول SIA الملحي، وذلك للحفاظ على التخدير الجزئي أثناء توصيل الأقطاب الكهربائية.

بعد ذلك، ضع الكتلة الفموية مع المحلول في طبق بتري ذو قاعدة سيجارية، مع القطع عبر الشريان الفموي الموجود على السطح البطني للكتلة الفموية. ثم قم بإزالة العقد الجنبائية والقاعدية عن طريق قطع اتصالاتها بالعقدة الدماغية. اترك العقدة الدماغية متصلة بالعقد الفموية والكتلة الفموية عبر CBCs، واقطع الاتصالات الأخرى بين العقدة الدماغية والكتلة الفموية.

قُم بقص المريء والغدد اللعابية إلى أطوال قصيرة. في هذه الخطوة، ثبّت الأقطاب الكهربائية الخطافية على عين العصب الولاري (ular nerve eye)، والعصبين العضليين الوجنيين الثاني والثالث، والفرع A من العصب الوجني الثاني. يتم ذلك باستخدام إجراء مشابه لما تم توضيحه في منشور JoVE بواسطة Collins وShield، والملخص هنا بإيجاز.

عند فصل كل قطب كهربائي، ضع القطب بالقرب من العصب أو العضلة، ثم ضع العصب المستهدف في الخطاف واربعه برفق باستخدام الملاعب. بعد ذلك، جفف جزء العصب باستخدام منديل Kim wipe. ضع كمية صغيرة من غراء السوبر سريع الجفاف (quick gel super glue) على العصب المثبت بالخطاف، وتأكد من تغطية الخطاف بالكامل بالغراء مع ضمان عدم تغطية طرف السلك المرجعي بالغراء.

بعد ذلك، تُستخدم حقنة مزودة بأنبوب بولي إيثيلين لنقل المحلول من الطبق ووضعه على الغراء، مما يؤدي إلى تصلب سطح الغراء. الخطوة التالية هي تحضير طبق تسجيل Pyrex مستدير بمقاس 100 في 50 مليمتر لاستخدامه كغرفة تسجيل؛ حيث يتم وضع طبقة رقيقة من شحم الفراغ (vacuum grease) على الثلم الموجود بين الغرفتين الدماغية والمنحنية باستخدام طرف ماصة لتقليل التسرب. ثم يتم ملء الغرفة الأمامية بمحلول ملحي من نوع plescia saline.

انقل الكتلة الخدية بعناية من طبق بتري إلى الغرفة الأمامية لطبق بايركس المستدير، وتأكد من عدم شد أي من الأقطاب الكهربائية بقوة، مما قد يؤدي إلى قطع الأعصاب. توخَّ الحذر الشديد عند التعامل مع الأقطاب ذات الخطافات إذا كان لا بد من نقل الطبق إلى مجهر تشريح ثنائي العينية آخر. وذلك لترقيق الغمد.

قم بتجميع الأقطاب الكهربائية الموجودة على كل جانب من الكتلة الخدية معاً. أمسك الأقطاب الكهربائية بعناية عن طريق الإمساك بالشريط اللاصق الذي يغطي دبابيس الموصل، وتأكد مرة أخرى من عدم شد أي من الأقطاب الكهربائية بقوة. عند وضع الطبق تحت المجهر، يجب أن تتدلى الأقطاب الكهربائية برفق فوق جوانب الطبق وتستقر على المنصة أثناء فترات التوقف وبين مراحل التجربة، وقم بتهوية المحلول الملحي في غرفة الكتلة الخدية باستخدام حجر هواء الحوض.

بعد ذلك، قم بتثبيت العقدة الدماغية في الغرفة الخلفية مع تمرير الـ CBCs عبر الثلمة. ضع المزيد من شحم الفراغ فوق الـ CBCs. ثم أضف المزيد من محلول SIA الملحي إلى كلا جزئي الطبق بحيث تكون العقد مغمورة تماماً.

تأكد من أن مستوى المحلول الملحي أقل من ارتفاع شحم التفريغ الموجود بين الحجرتين الدماغية والفموية لمنع حدوث أي تسرب بين الحجرتين. في هذه المرحلة، يجب أن تستقر الكتلة الفموية في قاع الحجرة الأمامية. بعد ذلك، قم بتثبيت العقد الفموية على المنصة الوسطى باستخدام الدبابيس لتجنب إتلاف الأعصاب التي لا تزال متصلة بالكتلة الفموية.

ضع الدبابيس فقط على الغمد الموجود بين عصبين. ثم أضف دبوسين إضافيين على جانب الـ CBCs لشدهما وتثبيتهما. حافظ على العقد البوكالية مسطحة أو مائلة بناءً على موقع الخلايا العصبية المستهدفة.

لتدوير العقدة الشدقية، استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك بجزء زائد من غمد الـ CBC وتثبيته بدبوس بين العصب الشدقي الثاني والعصب الشدقي الثالث. عندها يمكن رؤية معظم أجسام الخلايا القريبة من الحجرة الخلفية والتي لا يمكن الوصول إليها بسهولة من الجزء العلوي للعقدة الشدقية. وأخيراً، أضف دبوسين على غمد العقدة الشدقية بالقرب من جهة الكتلة الشدقية.

لتقليل حركة العقدة البلعومية، أمسك بغمد العقدة البلعومية بالقرب من الغرفة الخلفية، وقص الغمد الزائد باستخدام مقص دقيق دون كشف أجسام الخلايا. ومن أجل تقليل التلف، قم بإزالة القدر اللازم فقط من الغمد لرؤية أجسام الخلايا بعد الانتهاء من ترقيق الغمد. قم بتوصيل جميع دبابيس الأقطاب الكهربائية بمآخذها في الكابلات المتصلة بالمضخمات.

تأكد من عدم شد الأقطاب الكهربائية بقوة وأنها متصلة بشكل صحيح بالكابلات المناسبة وأن الأقطار صحيحة لغسل أي بقايا من كلوريد المغنيسيوم. استبدل محلول SIA الملحي في حجرة الكتلة الخدية بمحلول SIA ملحي جديد. بعد ذلك، مرر غرزة حريرية عبر الأنسجة الرخوة في مقدمة الكتلة الخدية وظهرياً بالنسبة لغضروف الفك.

استخدم قطعتين من صلصال التشكيل لتثبيت الخيط الجراحي بحافة الطبق، وبذلك يتم تعليق الكتلة الفموية من موضع طرفها الأمامي. استخدم مناولاً لإمساك قطب كهربائي خارج خلوي زجاجي بحيث يكون طرف القطب بالقرب من العقدة الفموية. ولتحديد موقع العصبون والتعرف عليه، قم بخفض طرف القطب الكهربائي خارج الخلوي برفق فوق الغمد.

فوق جسم العصبون. يتم تطبيق تيار تحفيزي، ثم تحويل القناة المستخدمة في تحفيز جسم العصبون إلى وضع التسجيل من أجل تسجيل النشاط على القطب خارج الخلية والنشاط المقابل على الأعصاب لتحفيز الرفض. وعلى غرار البرامج الحركية، يتم تحفيز العصب الفموي 2-أ (buccal nerve two A) بسلسلة طويلة من نبضات بتردد 2 Hz ومدتها 1 ms لتوليد أنماط الـ ees.

تستمر الأنماط طوال فترة التحفيز وقد تستمر حتى وقت قصير بعد انتهائه. لاستحثاث برامج حركية مشابهة للعض، ضع بضع بلورات من مادة caracol الصلبة مباشرة على العقدة الدماغية.

تبدأ الأنماط التكرارية عادةً في غضون خمس دقائق وتستمر لمدة تتراوح تقريبًا بين 10 إلى 15 دقيقة قبل أن تبدأ في التلاشي لتحفيز عملية البلع. وكما هو الحال في البرامج الحركية، قم بتطبيق caracol وانتظر حتى تولد الكتلة الفموية عضات قوية. بعد ذلك، وأثناء العض، ضع شريطًا من الأعشاب البحرية في فم الحيوان بحيث يتمكن من الإمساك بها.

يظهر هنا تحفيز وتسجيل العصبون الحركي المحدد B9، والتسجيل من العصبون نفسه، والعضلة I2، وعدة أعصاب أثناء برامج الحركة الغذائية. وهذه هي الصور المرئية المأخوذة من السلسلة ذاتها من برامج الحركة. وقد تم تحفيز أنماط البلع عن طريق تطبيق مادة carbahol على العقدة الدماغية، ثم وضع شريط من الأعشاب البحرية في الممسك أثناء عملية العض الناتجة عن carbahol.

في هذه الصورة، يتم مد المبرد (radula) للإمساك بالطحالب البحرية، وفي هذه الصورة، تراجع المبرد ساحباً الطحالب إلى داخل الفم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تحضير الكتلة الفموية المعلقة، والحصول على تسجيلات لبرامج التغذية الحركية في المختبر (in vitro).