عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا طلائية سنخية أولية من النوع الثاني تكون نقية وحيوية، وذلك لإجراء تحليلات وظيفية وجزيئية لاحقة. أولاً، يتم غمر الرئة والقصبة الهوائية لفأر مُضحّى به بمحلول من DYS displays ثم بالأجاروز. بعد ذلك، يتم استئصال الرئة بعد السماح لـ dispa بهضم الرئة.

يتم تفتيت النسيج يدويًا، ثم يُرشح المعلق الناتج عبر سلسلة من المناخل ذات أحجام مسام متناقصة. بعد ذلك، يتم عزل الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني والخلايا المصبوغة عن طريق الاختيار السلبي باستخدام قياس التدفق الخلوي.

في النهاية، يمكن استخدام الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني المعزولة لإجراء فحوصات وظيفية وجزيئية لدراسة دورها في العدوى التنفسية وأمراض المناعة الذاتية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الاستجابة المناعية الرئوية، لا سيما في سياق أمراض الرئة التي يتوسطها المناعة الذاتية والعدوى الفيروسية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم كيفية تحضير العضو ومعلق الخلايا.

يعتمد النجاح الإجمالي لهذا البروتوكول على عدة تفاصيل مهمة خلال هذه الخطوات. لكل فأر في التجربة، قم بتدفئة مسبقة لأنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على أربعة milliliters من DYS bays في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degrees Celsius. ضع كميات صغيرة من 1% low. Mel Aros في الماء في كتلة تسخين بدرجة حرارة 95 degrees Celsius حتى تتمييعها. ثم بردها إلى 45 degrees Celsius وحافظ عليها في درجة الحرارة هذه حتى يتم استخدامها لاحقاً.

لتحضير رئة الفأر، قم برش فأر تم التضحية به عن طريق الاختناق بـ CO2 باستخدام الإيثانول. ثم قم بإجراء قطع طولي على طول الخط الناصف البطني للجسم.

بعد ذلك، اسحب الجلد البعيد من الناحية البطنية، ثم قم بقص وإزالة البريتون بعناية. وبعد تفريغ الفأر من الدم، قم بثقب وإزالة الحجاب الحاجز بعناية، ثم قص الأضلاع. وللكشف عن القلب والرئة، توخَّ الحذر الشديد لعدم إصابة الرئة باستخدام كانيولا بقياس 26 gauge ومحقنة سعة 10 milliliter مملوءة بسائل بارد.

قم بثقب البطين الأيمن للقلب باستخدام PBS واغسل الرئة بـ PBS حتى يزول الدم منها. اقطع الغدد اللعابية وأزلها للكشف عن الرغامي. كما يجب قطع العضلات المحيطة بالرغامي بعناية.

بعد ذلك، يتم إدخال قنية وريدية مقيمة مقاس 22 في القصبة الهوائية. ثم تُسحب الإبرة ويُدفع القثطار البلاستيكي باتجاه الرئة. يتم تثبيت القثطار في مكانه عن طريق ربط قطعة صغيرة من الخيط حول القصبة الهوائية والقثطار.

إذا لزم الأمر، قم بتحضير عينة من سائل غسيل القصبات والأسناخ عن طريق غسل الرئتين باستخدام القسطرة المُدخلة في الرغامي بواسطة PBS أو الوسط الغذائي. يُحفظ سائل الغسيل على الثلج حتى يتم إجراء التحليل. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو عملية الهضم وتفكك الأنسجة.

لضمان نجاح هذا البروتوكول، يجب التأكد من ملء جميع فصوص الرئة بالكامل بمحلول dispa، وكذلك بعد هضم الأنسجة. يجب تفتيت الأنسجة باستخدام حقنة سعة 2 مل بحذر، مع حقن حجم أقصى قدره 2 مل من محلول dispa الذي تم تحضيره مسبقاً في الرئة عبر القثطرة لضمان تمدد جميع الفصوص بالكامل. استبدل الحقنة بحقنة سعة 1 مل تحتوي على 0.5 مل من محلول aros المميع، ثم قم بحقن المحتويات في الرئة.

اترك المحقنة متصلة بالقسطرة لمنع التدفق العكسي للهلام الهوائي، وقم بتغطية الرئة فوراً بمناديل مختبرية وورق وثلج. اترك الهلام الهوائي لبضع دقائق، ثم قم بإزالة المناديل الورقية والثلج والمحقنة والقسطرة.

بعد ذلك، اقطع الرغامي واستأصل الرئة والقلب والغدة الزعترية من الصدر. اشطف الأعضاء المُجهزة في طبق باستخدام PBS. ثم افصل القلب والغدة الزعترية وما تبقى من الرغامي عن الرئة وتخلص منها.

ضع الرئة في الأنبوب الذي يحتوي على المليلترين المتبقيين من المحاليل واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. قم بتغيير الاحتضان لضمان الحجب الفعال لمستقبلات FC في الخلايا البلعمية قبل إجراء عملية الصبغ. انقل الرئة من المحاليل إلى طبق يحتوي على سبعة مليلترات من جسم مضاد anti CD 1632 بتركيز 1 µg/mL و100 µL من DNAs في وسط DMEM، وباستخدام زوجين من الملاقط، قم بتفكيك أنسجة الرئة تماماً عن طريق سحبها بعيداً عن بعضها.

ثم يتم تحضينها لمدة 10 minutes في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز (rocker) مضبوط على 200 RPM إذا لزم الأمر. يمكن بعد ذلك تخزين معلق الخلايا في درجة حرارة أربع degrees Celsius حتى الخطوة التالية. يتم نقل معلق الخلايا باستخدام الماصة عبر سلسلة من المصافي النايلونية.

أولاً، اسكب المعلق عبر مرشح بمسامية 100 micron موضوع فوق أنبوب سعة 50 milliliter. في حالة تجميع العينات، مرر معلقات الخلايا من الفئران التابعة للمجموعة ذاتها عبر المرشح نفسه. وإذا انسد المرشح، استبدله بآخر جديد.

كرر هذه العملية باستخدام مرشح شبكي بمسام 70 micron. احرص على شطف كل شبكة بالإضافة إلى الأنابيب والأطباق جيداً باستخدام DMEM لتقليل فقدان الخلايا وزيادة الإنتاجية إلى أقصى حد. بعد ذلك، اسحب المعلق عبر مرشح شبكي بمسام 48 micron ممدد فوق حلقة بلاستيكية أو زجاجية كما هو موضح هنا.

اجمع السائل المتدفق في طبق بتري. ثم كرر هذه العملية باستخدام مصفاة ذات مسام بحجم 30 ميكرون. وبناءً على الحجم، انقل الرشاحة إلى أنبوب أو أكثر سعة 50 ملليلتر، وقم بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بسرعة 160 ×g عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 2 milliliters من محلول تحلل كريات الدم الحمراء. بعد ذلك، قم بإيقاف عملية التحلل بسرعة عن طريق إضافة 13 milliliters من وسط DMEM. انقل المحلول إلى أنبوب سعة 15 milliliter وقم بإجراء الطرد المركزي لمدة 12 minutes عند 160 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

قم بتعليق الخلايا في 3 mL من مزيج أجسام مضادة أولية يحتوي على أجسام مضادة ضد CD 11 C و CD 11 BF و F4/80 و CD 19 و CD 163 و CD 45. تُحضن الخلايا لمدة 10 دقائق في الظلام عند درجة حرارة 4 °C أو على الثلج. بعد التحضين، تُغسل الخلايا بملء الأنبوب بوسط DMEM ثم تُفصل بجهاز الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة بسرعة 160 ×g وعند درجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق الخلايا في 1 mL من وسط DMEM وقم بإجراء ترشيح أولي عبر مرشح بمسامية 50 micron في أنبوب مخصص لفرز الخلايا. قم بعدّ الخلايا لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في معلق الرئة. استخدم فوهة بقطر 100 micro لفرز خلايا EC2 مباشرة قبل البدء في عملية الفرز.

امزج معلق الخلايا باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortex). يعتمد ضغط السائل والأطوال الموجية لانبعاث الليزر والكشف عليه على الجهاز المستخدم في فرز الخلايا بالتدفق الخلوي، بالإضافة إلى الفلوروكروما المستخدمة في إجراء صبغ الأجسام المضادة. أولاً، قم بإنشاء مخطط لمنطقة التشتت الجانبي مقابل الفلورة، ثم حدد بوابة (gate) تشمل جميع الخلايا ذات التشتت الجانبي العالي والسالبة للفلوروكروما المستخدمة في الصبغ.

بعد ذلك، قم بإنشاء مخططات مساحة التشتت الجانبي مقابل مساحة التشتت الأمامي، وارتفاع التشتت الأمامي مقابل مساحة التشتت الأمامي، وارتفاع التشتت الجانبي مقابل مساحة التشتت الجانبي، ثم قم بعمل بوابة (gate) لاستبعاد أي مضاعفات أو تجمعات خلوية أثناء الفرز في أنبوب يحتوي على DMEM. عند فرز معلقات الخلايا الرئوية المعزولة من فئران سليمة، فإن بوابة EC2 ستمثل عادةً حوالي 42 ± 10% من إجمالي الأحداث. ولجمع الخلايا المفروزة، قم بالتبطئة باستخدام جهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 280 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني أو EC2 في وسط استزراع أو محلول منظم حسب ما تتطلبه التحليلات اللاحقة. تم عزل الخلايا الظهارية السنخية الأولية من النوع الثاني للفئران عن طريق الاختيار السلبي باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في هذا الفيديو، ويظهر هنا تحليل الخلايا التي تم فرزها، كما هو مبين.

تبلغ نقاوة الخلايا المعزولة حوالي 92 ± 5%. تم صبغ الخلايا من النوع A EC2 التي تم فرزها لبروتين surfactant protein C؛ حيث تظهر صورة تباين الطور على اليسار وصورة التألق المناعي على اليمين. وجد أن ما يقرب من 100% من الخلايا كانت موجبة لبروتين surfactant protein C، مما يؤكد نجاح عزل مجموعة نقية. ولتقييم آثار الإصابة بفيروس الإنفلونزا A داخل الجسم، تم عزل خلايا A EC2 من فئران C 57 BL six التي حُقنت إما بمحلول ملحي منظم بالفوسفات أو بفيروس الإنفلونزا A PR eight A 34 عن طريق الأنف قبل يوم أو يومين أو ثلاثة أيام.

توضح هذه المخططات معلقات خلايا رئوية من ذكور فئران C 57 black six غير مصابة وأخرى مصابة منذ ثلاثة أيام، تم صبغها بغرض الفرز نظراً لاستقطاب الخلايا المناعية إلى الرئة المصابة. وقد انخفضت نسبة الخلايا ذات الفلورة السلبية والتبعثر الجانبي المرتفع بشكل ملحوظ في معلق الخلايا المحضر من الفئران المصابة لمدة ثلاثة أيام مقارنة بالفئران غير المصابة. تم تحليل تعبير البروتين النووي لفيروس Influenza A الذي تم فرزه بواسطة C two من خلال التلوين داخل الخلايا باستخدام جسم مضاد محدد للبروتين النووي.

يوضح المدرج التكراري أن خلايا C two المعزولة من فئران مصابة في الجسم الحي تعطي إشارة فلورية محددة بعد الصبغ داخل الخلايا لبروتين النواة الخاص بفيروس الإنفلونزا A. ويوضح الجدول متوسط شدة الفلورة لصبغ البروتين النووي، حيث تزداد شدة الإشارة الناتجة عن الصبغ داخل الخلايا للبروتين النووي في خلايا EC2 المعزولة من فئران مصابة بفيروس الإنفلونزا A مع زيادة مدة العدوى الفيروسية، وذلك لإثبات حيوية خلايا EC2 المعزولة من فئران سليمة واختبار مدى قابليتها للإصابة بعدوى فيروس الإنفلونزا A.

تم أيضاً تحليل تعبير البروتين النووي الفيروسي لفيروس Influenza في الخلايا المعزولة والمصابة X vivo كما هو موضح هنا. حيث تعبر نسبة كبيرة من EC2 عن البروتين النووي الفيروسي بعد ست ساعات من الإصابة. وهذه البيانات ملخصة هنا.

تعتمد نسبة الخلايا EC2 الإيجابية في الصبغ داخل الخلوي للبروتين النووي الفيروسي على الجرعة الفيروسية المستخدمة في تجربة العدوى خارج الجسم (ex vivo). وتظهر هذه النتائج أن العصبونات الأولية المعزولة، وهي خلايا EC2، حيوية وقابلة للإصابة بالعدوى الفيروسية والتضاعف، وهو ما تم تقييمه من خلال التعبير المرئي للبروتين الفيروسي. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم جداً تذكر تنفيذ جميع خطوات هضم وتفكيك الأنسجة بعناية.

كذلك، من المهم جداً تذكر ضبط البوابة (gaiting) بدقة على الخلايا السلبية للفلورة والخلايا الموجودة في منطقة side scatter العالية. عند الفرز باتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الدراسات الجزيئية والوظيفية لاستبعاد دور الخلايا من النوع الثاني والنوع الثالث في الرئة في سياق الإصابات الفيروسية وأمراض الرئة المناعية الذاتية.