مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خلايا عارضة للمستضد اصطناعية (A APC) تعتمد على CD 1D من أجل توسيع خلايا NK T. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة البروتينات لإضفاء الوظيفة على الخرز المغناطيسي. وفي الخطوة الثانية، يتم إثراء تعداد خلايا NK T الأولي المستخلص من الدم المحيطي.

بعد ذلك، يتم إجراء مستنبت مشترك للخلايا التائية المثرية مع A A PC. وفي الخطوة النهائية، يتم تقييم النمط الظاهري ووظيفة مجموعة خلايا A A PC. وفي النهاية، يمكن تحديد نقاء المجموعات الفرعية للخلايا التائية الموسعة عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. وتتمثل الميزة الرئيسية لـ APCs مقارنة بالطرق الحالية التي تستخدم الخلايا التغصنية في إمكانية وجود تباين عالٍ بين المتبرعين عند استخدام الخلايا التغصنية.

توفر الخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية (APCs) طريقة قياسية وقابلة للتكرار وجاهزة للاستخدام لتوسيع الخلايا التائية القاتلة الطبيعية (NK T cells). لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أعمل مع الدكتور Schneck وزميله في جامعة جونز هوبكنز، حيث كانوا روادًا في مجال استخدام مجمعات تقديم المستضد الاصطناعية لتوسيع المجموعات الفرعية التقليدية من الخلايا التائية CD8.

سيقوم بتقديم الإجراء الدكتور جيمس إيست، وهو زميل ما بعد الدكتوراه، وابن الدكتورة ويندي، وهو باحث مشارك من مختبري. ابدأ بنقل 1 mL من حبيبات dyna bead M four 50 epoxy إلى قارورة زجاجية شفافة من البورسليكات سعة 5 mL ذات غطاء لولبي. ثم اشطف الحبيبات باستخدام 3 mL من محلول bore eight buffer المعقم في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL.

أضف 100 micrograms من human CD 1D IG dimer، و20 micrograms من الجزيئات التحفيزية المشتركة المطلوبة إلى 1 milliliter من PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك، ضع القارورة الزجاجية التي تحتوي على الخرزات على مغناطيس وقم بشفط محلول البورات المنظم. ثم أضف خليط البروتين إلى القارورة الزجاجية وأغلق الغطاء.

امزج المحلول فوراً عن طريق قلب القارورة، ثم غطِّ الغطاء بـ paraform وضعها على جهاز تدوير (rotator) طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي، ضع القارورة الزجاجية على المغناطيس مرة أخرى وأزل خليط البروتين بعناية مع تجنب سحب الخرز. اغسل الخرز ثلاث مرات عن طريق إضافة 3 mL من محلول غسل الخرز (bead wash buffer) وتحضينها على جهاز التدوير عند درجة حرارة 4 °C لمدة 5 دقائق.

للتأكد من تحميل البروتينات بشكل مستقر على الخرزات، قم بصبغ جزء من الخرزات باستخدام الأجسام المضادة وتحليلها بواسطة تحليل التدفق الخلوي. الآن، انقل 5×10⁷ من الخرزات إلى قارورة زجاجية صغيرة سعة 1.5 milliliter واغسل الخرزات بـ 1 milliliter من PBS المعقم. ثم اتركها لمدة 48 إلى 72 ساعة قبل الاستخدام.

يتم تحميل الخرزات المغسولة بالمستضد في 1 mL من محلول PBS المعقم أثناء عملية التحميل. يتم تجميع خلايا PBMC عن طريق تخفيف دم المتبرع المعالج بالهيبارين أولاً بحجم مساوٍ من محلول PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يُضاف 15 mL من محلول PHI في درجة حرارة الغرفة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 mL، ثم يُوضع 25 mL من خليط الدم المخفف ببطء فوق محلول PHI.

بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً لمدة 30 دقيقة عند 700 ×g وفي درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل المكابح. استخدم ماصة باستور لنقل الطبقة البينية للخلايا اللمفاوية بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. بعد ذلك، اغسل الخلايا اللمفاوية في 50 مل من PBS، مع التخلص من الطافي ودمج الأنابيب المأخوذة من متبرع واحد في أنبوب واحد.

بعد غسل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) مرة أخرى باستخدام 20 milliliters من PBS، قم بعدّ الخلايا ثم أعد تعليقها بتركيز 5 × 10⁷ خلية لكل milliliter في max buffer. لعزل جزء الخلايا التائية (T-cell)، قم بتحضين 100 microliters من محلول إثراء الخلايا التائية PAN من مجموعة EP human T-cell enrichment مع 2 milliliters من PBMC لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتحضين المحلول مع 100 microliters من الخرزات المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى.

أكمل الحجم النهائي للمذيب ليصل إلى 2.5 milliliters ثم ضع الأنبوب في المغناطيس. وبعد مرور خمس دقائق، صُب الجزء الموجب CD three بسرعة في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. الآن، اغسل الخلايا في 5 milliliters من منظم max البارد، ثم قم بعدّ الخلايا الحية.

قم بسحب عينة جزئية لصبغ التحقق لاختيار الخلايا الموجبة لـ CD 1 61 أولاً. أعد تعليق الخلايا التائية المثرية في 980 µL من max buffer المبرد على الثلج، ثم قم بتحضين الخلايا مع 10 µg من الجسم المضاد أحادي النسيلة anti CD 1 61 لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد غسل الخلايا، أعد تشكيل الراسب في 800 µL من max buffer و 200 µL من anti-US IgG one microbeads.

قم بحضن هذا المحلول عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق أخرى. وبينما يتم حضن الخلايا مع الخرزات الدقيقة، أضف 3 mL من منظم max buffer لموازنة عمود LS. وبعد غسل هذا الجزء من الخلايا، انقل الخلايا الموجودة في 3 mL من منظم max buffer ببطء إلى العمود باستخدام الماصة.

الآن، اشطف العمود ثلاث مرات باستخدام 3 mL من محلول max buffer الطازج. ثم أضف 3 mL أخرى من محلول max buffer الطازج إلى العمود وانقل العمود إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. قم بإخراج خلايا CD 1 61 positive CD three positive المنقاة، ثم قم بعد جزء خلايا NKT المخصب.

ابدأ هذه الخطوة بالاستنبات المشترك لـ 10⁶ من خلايا T المخصبة الموجبة لـ CD161 والموجبة لـ CD3 مع 10⁶ من خلايا APC في 16 مل من الوسط الغذائي الكامل. أضف 160 µL من الاستنبات المشترك لكل بئر في طبق بولي ستيرين ذي قاع على شكل حرف U معالج للزراعة النسيجية ومكون من 96 بئراً مع غطاء منخفض التبخر. في اليوم 12 إلى 14، قم بحصد الخلايا وعدّها. حلل المجموعات الخلوية باستخدام تحليل التدفق الخلوي، ثم كرر عملية الاستنبات المشترك.

يتم تجميد خلايا NKT الإضافية بعد الجولة الثانية من التوسيع، كما تم توضيحه للتو بالنسبة لخلايا NKT الموسعة. ولاختبار وظائف خلايا A A PC، يتم أولاً استزراع 5×10⁴ من خلايا NKT لكل بئر مع 5×10⁵ من خلايا A A PC في حجم نهائي قدره 200 µL من الوسط الغذائي الكامل في طبق 96 بئر بقاع على شكل حرف U. وبعد مرور 24 إلى 48 ساعة، يتم جمع الطافي من المزرعة الخلوية لتحليله بواسطة تقنية Eliza. يوضح الشكل الأول أن بروتينات CD 1D IG مثبتة بشكل مستقر على سطح الخرزات المغناطيسية كما هو موضح هنا.

يتم التعبير عن كل من الأجسام المضادة CD 1D IG و anti CD 28 على سطح الحبيبات المغناطيسية كما هو موضح في هذا الرسم البياني. تم استزراع هجين الخلايا التائية القاتلة الطبيعية (NK T cell hybridoma) من الفئران، وهو DN 30 2D three والموجب لـ V alpha 14، إما مع خلايا AAPC غير محملة بمستضد alpha galactosylceramide الذائب في الوسط، أو مع خلايا AAPC محملة بـ alpha galactosylceramide. بعد ذلك، تم جمع السوائل الطافية من المزرعة، وقياس إنتاج IL 2 بواسطة تقنية ELISA، مما يوفر طريقة بسيطة لاختبار كل دفعة من الخلايا المقدمة للمستضد. في هذه التجربة، تم إثراء الخلايا التائية في الدم المحيطي البشرية الموجبة لـ CD 1 61 والموجبة لـ CD three عن طريق الفصل باستخدام الحبيبات المغناطيسية.

تم تحفيز الخلايا بعد ذلك مرة واحدة أسبوعياً لمدة 14 يوماً باستخدام A A PC المحمل بـ alpha galera، ثم جرى تحليل تعبير V alpha 24 و V beta 11. ومن المهم الإشارة إلى أنه تبين أنه حتى مع وجود تعداد أولي منخفض نسبياً من خلايا NKT بنسبة 0.03%، فقد أمكن توسيع الخلايا لتصل إلى مجتمع إيجابي لـ V alpha 24 و V beta 11 بنسبة 67% تقريباً. هنا، تم تحضين خلايا C one R CD 1D مع خلايا NKT بالنسب المحددة في وجود أو غياب مستضد Alpha Gal SER في أطباق U bottom ذات 96 بئراً لمدة تتراوح من 20 إلى 24 ساعة.

ثم تم تقييم تحلل الخلايا لخط خلايا ليمفوما الخلايا B بوساطة خلايا NKT عن طريق مقايسة تحرر الكروميم. كانت خلايا NKT الموسعة بواسطة PC قادرة على تحليل خط خلايا الليمفوما هذا. في وجود أو غياب alpha galera، تم توسيع خلايا NKT من PBMC لكل من المتطوعين الأصحاء ومرضى السرطان، وتم تحميل alpha galera.

لقد تمكن جهاز الحاسوب الشخصي (PC) من توسيع مجموعات خلايا NKT من كلتا المجموعتين. عند استخدام مجموعة بداية مكونة من 2 مليون خلية T إيجابية لـ CD 1 61 وإيجابية لـ CD three، يمكن الحصول على أكثر من 10⁷ خلية بعد جولتين من التوسيع. ويمكن استخدام خلايا NKT الموسعة في الدراسات الوظيفية كما هو موضح هنا.

تظل خلايا NKT التي تم توسيعها خارج الجسم مستجيبة لتحفيز Alpha GAL وتظل منتجة بقوة لـ IL 17 A وTNF alpha وإنترفيرون جاما. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا كان تعداد مجتمع إثراء الخلايا التائية الأولي منخفضاً وتعذر إجراء خطوة إثراء CD 1 61 الثانية، فقد لا يؤدي التوسع بوساطة A A PC إلى النتائج المتوقعة. ومع ذلك، إذا كانت نسبة خلايا NKT الدوارة أعلى من 0.1%، فإنه لا يزال من الممكن الحصول على توسع ملحوظ في خلايا NKT غير المتغيرة.

تثبت هذه البيانات مجتمعة أن خلايا A A PC القائمة على CD 1D يمكن استخدامها لتوسيع وتحفيز خلايا NK T البشرية الأولية بفعالية. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل QPCR للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد حركية تنشيط خلايا NK T بعد تطويرها. وتمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الكبد لاستكشاف دور خلايا NKT في مرض الكبد الدهني.