الإرواء داخل الأوعية من الحبر أسود الكربون تسمح برؤية موثوق من الأوعية الدماغية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة التشريح الوعائي الدماغي لدى الفئران بطريقة قابلة للتكرار. أولاً، يتم صبغ الأوعية الدماغية باستخدام لاتكس ملون للمقارنة لاحقاً مع صبغة حبر الكربون الأسود. بعد ذلك، يتم خلط أحبار الكربون الأسود ويتم تروية الحيوانات بمزيج من P-B-S-P-F-A وحبر الكربون الأسود عبر البطين الأيسر.

خلال الخطوة النهائية، يتم جمع الدماغ والتقاط صور للمقارنة وتحليل الأوعية الدماغية المصبوغة. وفي النهاية، يُستخدم برنامج Image J لتحليل نقاط التفاغم بين الشرايين الدماغية الوسطى والأمامية. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج أمراض الأوعية الدموية الدماغية، وخاصة السكتة الدماغية، حيث يمكن استخدامها لتحليل الكثافة الوعائية وتكون الأوعية الدموية.

يمكن لهذه الطريقة الآن توفير رؤية متعمقة للجهاز الوعائي في الدماغ، كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى، مثل تصوير الأوعية الدقيقة في القلب أو الكبد أو الكلية. بعد دمج اللاتكس مع حبر أسود الكربون في أنبوب EP، يتم تسخين الخليط عند 37 درجة Celsius في حمام مائي. استخدم إبرة قياس 23 إلى 25 gauge لسحب اللاتكس الدافئ في سرنجة سعة 2 milliliter.

ثم قم بإذابة 12.5 milligrams من مسحوق papine hydrochloride في واحد milliliter من المحلول الملحي الطبيعي المعقم، وبعد استخدام جهاز الرج (vortexing)، اجمع المحلول الناتج في حقنة أنسولين. بعد ذلك، اقطع إبرة حقنة أنسولين معقمة أخرى، وضع الإبرة المفصولة على طرف أنبوب PE 10 بطول 20 centimeter. ثم قم بتوصيل أنبوب PE 10 بإبرة حقنة الأنسولين التي تحتوي على محلول Papine hydrochloride.

الآن، املأ حقنتين إضافيتين من حقن الإنسولين بـ 1 mL من المحلول الملحي، ثم انقل جميع الحقن مع أدوات التشريح المعقمة إلى منصة العمليات قبل البدء في التخدير. قم بوزن الفأر، ثم ضع الفأر المخدر باستمرار على ظهره. قم بتثبيت الأطراف واقطع الجلد فوق الوريد الفخذي الأيسر.

حدد الآن موقع الوريد الفخذي وأدخل طرف الإبرة المتصلة بأنبوب PE 10. ثم احقن محلول Papine hydrochloride ببطء بمعدل حوالي 100 µL في الدقيقة وبجرعة 50 mg لكل كيلوغرام من وزن الجسم. بعد الحقن، قم بفتح التجويف البطني ثم اثقب الحجاب الحاجز.

بعد ذلك، قم بقطع الأضلاع لكشف القلب واستخدم ملقط الشرايين لغلق الأبهر الصدري النازل. بعد ذلك، قم بإجراء قطع حاد فوق الأذين الأيمن لتصريف الدم الوريدي. ثم احقن 2 mL من المحلول الملحي في البطين الأيسر.

يمكن أن يؤدي وجود الهواء في محاليل Profil أو في خليط الحبر المدمج إلى بقاء مناطق وعائية في الدماغ دون صبغ. ولضمان النجاح، يرجى التحقق بدقة شديدة من خلو جميع المحاقن تماماً من فقاعات الهواء. الآن، قم بحقن محتويات المحاقن المملوءة مسبقاً برفق، واحدة تلو الأخرى، للحقن اليدوي للاتكس الملون على مدى فترة تتراوح من 18 إلى 20 ثانية، ثم اترك الحيوان لمدة خمس دقائق.

بعد قطع رأس الحيوان، قم بإزالة عظم الجمجمة والسحايا مع الحرص على عدم إصابة القشرة المخية أو بنية الأوعية الدموية، ثم استخرج الدماغ كاملاً بعناية. ضع الدماغ في طبق زرع خلوي بقطر 60 مليمتر يحتوي على 6 إلى 8 مليلتر من 4%PFA، ثم ضع مسطرة قياس تحت الطبق باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر الجراحي. التقط صوراً بتكبير 25x للسطحين الظهري والبطني للدماغ بزاوية 90 درجة بين عدسة المجهر وطبق بتري.

من أجل قياس المسافة الأصلية، ابدأ إجراء الصبغ بحبر أسود الكربون عن طريق خلط حصتين بحجم 100 µL من حبر herts stemple farba أو CB one مع حصتين بحجم 900 µL من حبر pelican scribal schwartz أو CB two في أنبوبين منفصلين من أنابيب EP سعة 1.5 mL. اجمع مخاليط الحبر في حقنتين منفصلتين من حقن الإنسولين سعة 1 mL. ثم أغلق الحقن وضعها في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، جنبًا إلى جنب مع حقنتين أخريين من حقن الإنسولين تحتوي كل منهما على 1 mL من المحلول الملحي.

بعد معالجة الفأر كما تم توضيحه، استخدم ضغطاً خفيفاً لحقن كلا محلولي حبر أسود الكربون في البطين الأيسر بمعدل 18 إلى 20 ثانية لكل مليلتر. بعد استئصال الدماغ والتقاط الصور كما تم توضيحه، ضع الدماغ في 4%PFA طوال الليل، ثم يليه تحضين في تركيزات متزايدة تدريجياً من السكروز حتى ينغمر الدماغ العائم تماماً. ابدأ هذه الخطوة عن طريق تحفيز نقص تروية دماغي بؤري عابر.

وفقاً لبروتوكول قياسي لسد التجويف الداخلي للشريان الدماغي الأوسط، وفي نهاية فترة إعادة التروية، قم بصبغ الأوعية الدموية باستخدام أحبار CB one و CB two كما تم توضيحه للتو، ثم اصبغ الدماغ بالكامل باستخدام محلول 2%TTC عند درجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق. ولتحديد حجم الاحتشاء، ستظل منطقة الاحتشاء باللون الأبيض، بينما ستتحول المنطقة غير الإقفارية إلى اللون الأحمر. قم بالتقاط الصور كما تم توضيحه للتو لتحليل التشريح العياني للأوعية الدماغية، وابدأ بفتح صورة للسطح المصبوغ من الدماغ.

باستخدام برنامج Image J، قد تُظهر الأدمغة التي تم ترويتها بـ latex ملون درجات متفاوتة من تلوين الأوعية الدموية الموجودة على السطح البطني. بينما تؤدي التروية باستخدام CB one plus CB two إلى تلوين جميع الأوعية الدموية على كلا السطحين البطني والظهري. قم بضبط المقياس بالمليمترات، وحدد نقاط التفاغرات بين الشريان المخي الأمامي (a CA) والشريان المخي الأوسط (MCA) لإنشاء خط وهمي يربط جميع نقاط التفاغر هذه.

الآن، قم بقياس المسافة بين خط المفاغرة والخط المتوسط عند أربعة، ثم ستة مليمترات من القطب الجبهي للدماغ. بعد تحليل ثلاث إلى أربع صور لكل حيوان، احسب القيمة المتوسطة. قارن القيم بين المجموعات المختلفة من الحيوانات لتحديد التباين في التشريح الوعائي الدماغي.

في حيوانات C 57 black six J، يمكن تتبع خط التفاغُر بين a CA و MCA ليكون أقرب إلى الخط المتوسط عند مسافة أربعة مليمترات منه عند ستة مليمترات قياساً من القطب الجبهي، بينما لا تظهر الفئران التي تعاني من نقص في البروتين الدهني APO lipoprotein e أي فرق معنوي في هذا الصدد. وفي المقابل، يقع خط التفاغُر في فئران SV 1 29 في موضع أبعد وأكثر توازياً مع الخط المتوسط، سواء عند أربعة مليمترات أو ستة مليمترات، قياساً من القطب الجبهي لتحليل التشريح الوعائي. وفي ظل ظروف نقص التروية، يتم تحديد حدود الاحتشاء على أنها الحافة النسيجية الملونة بالأحمر والأبيض، والتي تمثل النسيج النشط أيضياً والنسيج النخري على التوالي؛ ثم يتم قياس مسافة حدود الاحتشاء من الخط المتوسط عند أربعة مليمترات وعند ستة مليمترات قياساً من القطب الجبهي للدماغ.

يتغلب البروتوكول الموصوف هنا على القيود التقنية للتصوير التقليدي للأوعية الدموية الدماغية للقوارض باستخدام اللاتكس. وكما تظهر هذه الصورة الأولى بعد تروية اللاتكس الملون، فإن الأوعية الكبيرة الموجودة على السطح البطني فقط هي التي تصبغ، بينما يظل السطح الظهري بالكامل غير مصبوغ. وفي المقابل، تؤدي التروية باستخدام CB one مع CB two إلى ملء كافٍ لكل من الأوعية الصغيرة والكبيرة بطريقة متساوية.

يظل التلوين مستقراً لمدة سبعة أيام دون أي تغيير في الجودة. وباستخدام برنامج Image J، يمكن تحليل المسافة بين نقاط التفاغر بين A CA و MCA من الخط الناصف في جميع مجموعات الفئران المختلفة، والتي تم ترويتها بالأحبار لتقييم الاختلافات في التشريح الوعائي الإقليمي. ورغم أن تعطيل POE لا يؤثر على البنية التشريحية للأوعية الدماغية في فئران C 57 black six J، إلا أنه يمكن ملاحظة فرق معنوي بين سلالتي C 57 black six J و SV 1 29.

في نماذج السكتة الدماغية التجريبية لدى القوارض، يُستخدم صبغ TTC على نطاق واسع لتصوير حجم المنطقة المصابة باحتشاء. كما يمكن تطبيق صبغ CB one plus CCB two في الظروف الإقفارية لملاحظة التغيرات الهيكلية في الأوعية الدموية، وهو يظهر استقراراً عالياً عند دمجه مع صبغ TTC. لاحظ التصوير المتزامن للأوعية الدماغية وحجم الاحتشاء في الأدمغة الإقفارية الناتجة عن مدد مختلفة من نقص التروية الدماغية ونقاط زمنية متفاوتة لإعادة التروية.

يظهر تحليل نقاط التفاغر بين الشرايين السباتية والشريان الدماغي الأوسط بعد 45 أو 90 دقيقة من نقص التروية، المقترنة بفترات إعادة تروية لمدة يوم واحد أو خمسة أيام، كما هو متوقع، أن متوسط الفرق بين الخط الناصف ونقاط التفاغر لم يظهر فرقاً جوهرياً بين المجموعات. علاوة على ذلك، كان متوسط المسافة ضمن النطاق نفسه الملاحظ في الحيوانات غير المصابة بنقص التروية. ومع ذلك، تختلف المسافة من الخط الناصف إلى حدود الاحتشاء بشكل ملحوظ بين المجموعات، مما يعكس زيادة حجم الاحتشاء مع ارتفاع درجات إصابة إعادة التروية بعد نقص التروية.

تمتلك هذه التقنية القدرة على تمهيد الطريق للباحثين في مجال السكتة الدماغية التجريبية من أجل استكشاف المناطق الوعائية في دماغ الفأر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية دراسة الأوعية الدموية الدماغية، وهي بنية تشريحية في الفئران، عن طريق تروية الدماغ بأحبار اللاكس أو أحبار الكربون الأسود، وكيفية تحليل أنسجة الدماغ المصبوغة الناتجة بمساعدة برنامج Image J.