تحديد مواد متطايرة الشم باستخدام الغاز اللوني موضوع وحدة تسجيلات (GCMR) في الفص Antennal الحشرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المواد العطرية الفعالة بيولوجياً في حاسة الشم من خلال التسجيلات في دماغ نحلة الطنان. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع المواد ذات التأثير السلوكي، وثانياً، تحضير جهاز الكروماتوغرافيا الغازية وأنظمة التسجيل متعددة القنوات للتجربة. وتتمثل الخطوة الثالثة في تحضير وتشريح دماغ نحلة الطنان لإجراء التسجيلات العصبية في الفص الهوائي.

تُجرى التجربة بعد ذلك عن طريق إدخال الأقطاب الكهربائية في فص قرن الاستشعار وقياس الاستجابات للمواد المتطايرة التي يتم نفخها من خلال تحليل النشاط العصبي استجابةً للروائح المركبة ومكوناتها الفردية. ويمكن بذلك تحديد المواد الشمية ذات النشاط البيولوجي التي يتم الحصول عليها عن طريق الكروماتوغرافيا الغازية. لذا، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الأخرى مثل G-C-E-A-G، هي حساسية الخلايا العصبية في قرن الاستشعار والقدرة على توصيف كيفية استجابة الخلايا العصبية في الدماغ لمواد متطايرة زهرية محددة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم الخطوات التحليلية الكيميائية والكهروفيزيولوجية المدمجة بسبب تقنية تسجيل التحضير الكهروفيزيولوجي والخطوات الضرورية لجمع المواد المتطايرة من الحيز الرأسي. ورغم أن هذه التقنية يمكن أن توفر رؤى حول المعالجة الشمية لدى نحل الطنان، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل عوامل نقل الأمراض كالبعوض أو البق القابل للتقبيل، أو الآفات الزراعية مثل المن أو العث. لهذا الإجراء، قم بتجهيز قطب مرجعي مصنوع من سلك التنجستن على ميكرو-مناور (micro manipulator) على جهاز ثانٍ.

يحتوي الملاعب الدقيق (Micro manipulator) على قطب كهربائي متعدد القنوات، مثل سلك ملفوف أو tede أو قطب كهربائي سيليكوني متعدد القنوات متصل بمضخم أولي، ويشتمل على جهاز كروماتوغرافيا غازية (gas chromatograph) ذي مخرج على طاولة BNC محمية. يتم ربط مخرج كاشف جهاز الكروماتوغرافيا الغازية بالمضخم ونظام الحصول على البيانات بحيث يتم تزامُن كل من الإشارات العصبية وإشارات الكروماتوغرافيا الغازية. في هذا المثال، يكون الغاز الحامل في جهاز الكروماتوغرافيا الغازية هو الهيليوم ويوجد في عمود DB five GC.

يستخدم جهاز GC منفذ حقن بنمط التقسيم (split inlet) مع ضبط درجة الحرارة عند 200 °C، كما تم ضبط درجة حرارة كاشف التأين اللهبي عند 230 °C. بعد تسخين العينات في جهاز GC، يتم تقسيم التدفق الخارج من العمود بنسبة واحد إلى واحد بين كاشف التأين اللهبي وهوائي B باستخدام وصلة زجاجية على شكل Y. في هذا المثال، يُستخدم جهاز GC لإيصال المواد المتطايرة التي تم جمعها عن طريق الامتصاص الديناميكي من أزهار نبات *Mimus lewisii*، وهو زهرة برية جبلية موطنها الأصلي كاليفورنيا.

وبدلاً من ذلك، بدلاً من استخدام جهاز gc، يمكن إيصال مركبات متطايرة منفردة أو مخاليط من المركبات عن طريق نبضات هوائية، حيث يتم دفعها عبر حقنة زجاجية منفصلة تحتوي على قطعة من ورق الترشيح التي رُسبت عليها المركبات. ويتم تحويل نبضات الهواء من تيار هوائي مستمر باستخدام صمام يتم تنشيطه بملف لولبي ويتم التحكم فيه بواسطة جهاز كمبيوتر.

ابدأ التحضيرات بقطع حوالي واحد سنتيمتر من طرف رأس ماصة سعة واحد ملليلتر. ضع نحلة طنانة في قاعدة رأس الماصة وادفعها برفق نحو الطرف المقابل حتى لا يتبقى سوى الرأس مكشوفاً. باستخدام شمع الأسنان المصهور، اصنع قالباً حول الرأس المكشوف.

يجب أن يلتصق الشمع بالعيون المركبة لتثبيت الرأس تماماً، مع مراعاة عدم ملامسة قرون الاستشعار إذا لزم الأمر. استخدم دبابيس صغيرة لتثبيت قرون الاستشعار. بعد ذلك، قم بعمل شق على شكل نافذة مربعة في كبسولة الرأس باستخدام شفرة حادة مثل المشرط الدقيق.

ابدأ القص مباشرة خلف قرن الاستشعار وبجوار إحدى العيون المركبة. قص خطاً مستقيماً بين العينين. بعد ذلك، قص ظهرياً حتى ينحني كبسولة الرأس باتجاه الصدر.

استمر في القطع حتى الطرف المقابل لمحفظة الرأس. وأخيراً، اقطع عائداً إلى نقطة البداية لإكمال المربع. استخدم الملقط لإزالة الكيوتيكل.

يجب إزالة القشيرة المتاخمة لقرن الاستشعار، وإلا فإنها ستعيق القطب الكهربائي بمجرد كشف الدماغ. قم بغمر النسيج فوراً بالمحلول الملحي الخاص بالحشرات. تأكد من أن فصوص قرن الاستشعار مكشوفة جيداً.

بعد ذلك، استخدم بدقة ملقطاً رفيعاً جداً لإزالة الغمد حول العصب الموجود مباشرة فوق فصوص الهوائي. توخَّ الحذر الشديد لضمان عدم ثقب دماغ النحلة بالملقط. وبذلك يصبح تحضير النحلة جاهزاً للتسجيل الفيزيولوجي الكهربائي.

ابدأ بتثبيت النحلة المُجهزة في مشبك مثبت بقاعدة مغناطيسية. حافظ على ترويتها باستخدام محلول ملحي للحشرات يتم إمداده من خزان مزود بمتحكم في التدفق. الآن، أدخل القطب المرجعي في أنسجة الدماغ المقابلة.

بعد ذلك، أدخل القطب الكهربائي متعدد القنوات في فصوص قرون استشعار النحلة. وعندما تستقر الأقطاب الكهربائية في مكانها، انتظر من 30 إلى 60 دقيقة حتى تستقر التسجيلات.

خلال هذا الوقت، قم بتحضير النبضات خارج الخلوية من العصبونات عن طريق تحديد العتبة أيضاً. قد يتطلب الأمر تحديد العتبة يدوياً لبعض قنوات التسجيل الفردية نظراً لوجود ضوضاء في قنوات التسجيل. بعد ذلك، تحقق من صحة منحدر درجة الحرارة الخاص بتشغيل GC.

في هذا المثال، تبدأ درجة الحرارة عند 50 °C لمدة أربع دقائق، ثم تزداد بمعدل 10 درجات في الدقيقة وصولاً إلى درجة حرارة نهائية تبلغ 220 °C، أو يتم تثبيتها لمدة ست دقائق. وتعتبر التسجيلات العصبية مستقرة عندما تصبح أشكال الموجات للوحدات في قنوات التسجيل متسقة. وبمجرد الاستقرار، قم بتعبئة المحقنة برائحة الحيز الرأسي للأزهار وحقن الرائحة في منفذ حقن الرأس الخاص بجهاز gc.

ابدأ بعد ذلك فوراً بالتسجيل من الأقطاب الكهربائية بعد انتهاء تشغيل جهاز GC. اترك المستحضر ليرتاح لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم إما بحقن عينة أخرى في جهاز GC أو تحفيز المستحضر باستخدام مركبات متطايرة مفردة أو مخاليط من المركبات.

إذا توقف النشاط التلقائي فجأة أو تغير في أي نقطة، فافحص تقطير المحلول الملحي واترك التحضير ليرتاح لمدة 15 دقيقة. ثم إذا لم يستعد النشاط مستواه السابق، تخلص من التحضير. بعد التجربة، قم بتثبيت الدماغ مع إبقاء المجسات داخل النسيج، ثم استأصل الدماغ، وقم بإزالة المثبت وتجفيف الدماغ.

يمكن بعد ذلك تحديد مواقع قنوات التسجيل باستخدام المجهر البؤري من رائحة زهرة mimus Luci. يتم رصد العدد الإجمالي للمركبات المتطايرة من خلال جهاز GC، والذي يتراوح عادةً بين 60 و 70 مركباً.

تتكون رائحة Mimus Luci بشكل أساسي من المونو تيربينويدات، بما في ذلك beta myosin و alpha pinine. أما الجزء المتبقي من الرائحة فيتكون من مواد متطايرة سداسية الكربون. تم تحفيز عدة تحضيرات باستخدام 3 µL من مستخلص عين Mimus Lewis.

يظهر هذا التسجيل من إحدى الوحدات العصبية الثماني التي تم تسجيلها بواسطة القطب الكهربائي متعدد القنوات مدى انتقائية استجابة عصبون معين لمركبات تطايرية محددة. في هذا المثال، يظهر المركب dine. وفيما يلي استجابات ثماني وحدات عصبية.

كان حوالي نصف المجموعة غير مستجيب. وهذا أمر مفاجئ بالنظر إلى تنوع المركبات المتطايرة المنبعثة من الحيز الرأسي للزهور، ولكن هذه النتيجة متسقة بين التحضيرات وقد ورد ذكرها في دراسات أخرى. ويظهر معدل التنشيط الموحد للوحدات المستجيبة وجود انتقائية قوية لمجموعة من المواد الشمية.

أحدثت المواد العطرية المحددة بالأسهم أقوى الاستجابات، وهي demine و trans beta osain. لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الحشرة للتجربة ومن ثم إجراء التجربة باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية مع التسجيل متعدد القنوات.

بذلك يتمثل الهدف في تحديد المواد ذات الرائحة التي يُفترض أنها فعالة سلوكياً ضمن باقة عطرية معقدة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم اتباع هذا الإجراء بشكل صحيح. كما يمكن إجراء طرق أخرى، مثل الاختبارات السلوكية باستخدام المواد ذات الرائحة المحددة، من أجل التحديد الكامل لمدى فاعلية المواد المتطايرة في التوسط في الاستجابة السلوكية للحشرة.