تحديد مواد متطايرة الشم باستخدام الغاز اللوني موضوع وحدة تسجيلات (GCMR) في الفص Antennal الحشرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الروائح الفعالة بيولوجيا بالمعنى المعقد من خلال التسجيلات في دماغ النحل. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع إحساس التأثير السلوكي أولا ، وثانيا ، إعداد كروماتوجراف الغاز وأنظمة التسجيل متعددة القنوات للتجربة. الخطوة الثالثة هي تحضير وتشريح دماغ النحلة الطنان للتسجيلات العصبية في هوائي فص المصنع.

ثم يتم إجراء التجربة عن طريق إدخال الأقطاب الكهربائية في فص الهوائي وقياس الاستجابات للمواد المتطايرة المنتفخة عن طريق تحليل النشاط العصبي استجابة للحاسة المعقدة ومكوناتها الفردية. يمكن تحديد الروائح النشطة بيولوجيا التي تم الحصول عليها عن طريق كروماتوغرافيا الغاز. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية بالنسبة لتقنيات أخرى مثل G-C-E-A-G ، هي حساسية الخلايا العصبية لحمل الهوائي والقدرة على توصيف كيفية استجابة الخلايا العصبية في الدماغ لمواد زهرية متطايرة معينة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الخطوات التحليلية الفيزيولوجية الكهربية والكيميائية المدمجة بسبب تقنية تسجيل التحضير الفيزيولوجي الكهربي والخطوات اللازمة لجمع المواد المتطايرة في الرأس. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على المعالجة الشمية للنحل الطنان ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل عوامل المرض مثل البعوض أو حشرات التقبيل ، أو آفات المحاصيل مثل حشرات المن أو العث. لهذا الإجراء ، أعدت قطبا كهربائيا مرجعيا مصنوعا من سلك التنغستن على مناور صغير في الثانية.

المناور الصغير على قطب كهربائي متعدد القنوات ، مثل سلك ملفوف أو تيد أو قطب كهربائي متعدد القنوات من السيليكون متصل بمضخم مسبق يحتوي على كروماتوجراف غاز مع إخراج على طاولة BNC محمية. يتم ربط إخراج كاشف GCs بمكبر الصوت ونظام الحصول على البيانات بحيث تتم مزامنة كل من الإشارات العصبية و GC. في هذا المثال، الغاز الحامل GC هو الهيليوم وموجود في عمود DB five GC.

يستخدم GC مدخل قائمة منقسمة مع ضبط درجة الحرارة على 200 درجة مئوية ودرجة حرارة كاشف تأين اللهب مضبوطة على 230 درجة مئوية. بعد تسخين العينات في GC ، يتم تقسيم النفايات السائلة من العمود واحدا إلى واحد بين كاشف تأين اللهب والهوائي B باستخدام موصل زجاجي y. في هذا المثال ، يتم استخدام GC لتوصيل المواد المتطايرة التي تم جمعها عن طريق الامتصاص الديناميكي من زهور عين Mimus Lewis ، وهي زهرة برية جبال الألب موطنها كاليفورنيا.

بدلا من ذلك ، بدلا من استخدام gc ، يمكن توصيل المركبات المتطايرة المفردة أو مخاليط المركبات عن طريق نبضات الهواء. تم تصويره من خلال حقنة زجاجية منفصلة تحتوي على قطعة من ورق الترشيح التي تم ترسيب عليها المركبات. يتم تحويل نبضات الهواء من تيار هواء ثابت باستخدام صمام منشط بالملف اللولبي يتحكم فيه جهاز كمبيوتر.

ابدأ الاستعدادات بقطع حوالي سنتيمتر واحد من نهاية طرف ماصة سعة مليلتر واحد. ضع نحلة في قاعدة طرف الماصة وادفعها برفق باتجاه الطرف المقابل من الطرف حتى ينكشف الرأس فقط. باستخدام شمع الأسنان المذاب ، اصنع قالبا حول الرأس المكشوف.

يجب أن يلتصق الشمع بالعيون المركبة لشل حركة الرأس تماما ، لكن يجب ألا يتصل بالهوائي إذا لزم الأمر. استخدم دبابيس صغيرة لشل حركة الهوائيات. بعد ذلك ، قم بعمل نافذة مربعة مثل شق في كبسولة الرأس باستخدام شفرة حادة مثل مشرط صغير.

ابدأ في القطع مباشرة خلف الهوائي وبجوار إحدى العيون المركبة. قطع خط مستقيم بين العينين. بعد ذلك ، اقطع ظهريا حتى تنحني كبسولة الرأس إلى الصدر.

استمر في القطع إلى الطرف الآخر من كبسولة الرأس. أخيرا ، قلص إلى البداية لإكمال المربع. استخدم ملقط لإزالة البشرة.

يجب إزالة البشرة المجاورة للهوائي ، وإلا فإنها ستعيق القطب بمجرد تعرض الدماغ. قم على الفور بدمج الأنسجة مع محلول ملحي للحشرات. تأكد من أن فصوص الهوائي مكشوفة جيدا.

ثم استخدم بعناية زوجا من الملقط الدقيق جدا لإزالة الغمد المحيط العصبي مباشرة فوق فصوص الهوائي. احرص على عدم ثقب دماغ النحلة بالملقط. تحضير النحل جاهز الآن للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي.

ابدأ بربط النحلة المحضرة بمشبك مثبت على قاعدة مغناطيسية. حافظ على دمجها بشكل فائق مع محلول ملحي للحشرات يتم توصيله من خزان مزود بوحدة تحكم في التدفق. الآن أدخل القطب المرجعي في أنسجة المخ المقابلة.

بعد ذلك ، أدخل القطب متعدد القنوات في فصوص هوائي النحلة. عندما تكون الأقطاب الكهربائية في مكانها. انتظر من 30 إلى 60 دقيقة حتى تستقر التسجيلات.

خلال هذا الوقت ، استعد لارتفاع خارج الخلية من الخلايا العصبية عن طريق العتبة أيضا. قنوات التسجيل الفردية قد تكون هناك حاجة إلى تحديد العتبة اليدوية لبعض القنوات بسبب ضوضاء في قنوات التسجيل. بعد ذلك ، تحقق من صحة منحدر درجة الحرارة لتشغيل GC.

في هذا المثال، تبدأ درجة الحرارة عند 50 درجة مئوية لمدة أربع دقائق، ثم ترتفع بمقدار 10 درجات في الدقيقة إلى درجة حرارة نهائية تبلغ 220 درجة سلزية، أو تبقى لمدة ست دقائق. عندما تصبح أشكال الموجي للوحدات في قنوات التسجيل متسقة ، تعتبر التسجيلات العصبية مستقرة. بمجرد أن تستقر ، قم بتحميل المحقنة برائحة مساحة الرأس الزهرية وحقن الرائحة في منفذ حقن الرأس في gc.

ثم ابدأ على الفور في التسجيل من الأقطاب الكهربائية بعد انتهاء تشغيل GC. دع المستحضر يرتاح لمدة خمس إلى 15 دقيقة. ثم إما حقن عينة أخرى في GC أو تحفيز المستحضر باستخدام مركبات متطايرة مفردة أو مخاليط من المركبات.

إذا توقف النشاط التلقائي فجأة أو تغير في أي وقت ، فتحقق من التنقيط الملحي واترك المستحضر يرتاح لمدة 15 دقيقة. ثم إذا لم يستعيد النشاط مستواه السابق ، فتخلص من التحضير. بعد التجربة ، قم بإصلاح الدماغ مع المجسات التي لا تزال في الأنسجة ، ثم استئصال الدماغ ، وقم بتنظيف المثبت وتجفيف الدماغ.

يمكن بعد ذلك تحديد مواقع قنوات التسجيل عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر من رائحة الأزهار mimus Luci. العدد الإجمالي للمواد المتطايرة التي تنهب. يتراوح GC عادة بين 60 و 70 مركبا.

تتكون رائحة Mimus Luci في الغالب من التربينويدات الأحادية ، بما في ذلك بيتا ميوسين وألفا بينين. يتكون ما تبقى من الرائحة من ستة مواد متطايرة من الكربون. تم تحفيز العديد من المستحضرات بثلاثة ميكرولترات من مستخلص عين ميموس لويس.

يوضح هذا التسجيل من إحدى الوحدات العصبية الثماني المسجلة بواسطة القطب متعدد القنوات مدى تنافس الخلايا العصبية الانتقائية مع مواد متطايرة معينة. في هذا المثال ، تناول الطعام هو ذلك المركب الموضح. فيما يلي استجابات ثماني وحدات عصبية.

كان حوالي نصف المجموعة غير مستجيب. هذا مثير للدهشة نظرا لتنوع المركبات المتطايرة المشار إليها من فراغ الأزهار ، ولكن هذا متسق بين المستحضرات ويتم الإبلاغ عنه من قبل دراسات أخرى. يظهر معدل إطلاق النار الطبيعي للوحدات المستجيبة أن هناك انتقائية قوية لمجموعة من الروائح.

أثارت الروائح التي أبرزتها الأسهم أقوى الاستجابات. هذه هي ديمين وعبر بيتا أوسين. لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير حشرتك للتجربة ثم إجراء التجربة باستخدام كروماتوغرافيا الغاز مع تسجيل متعدد القنوات.

الهدف إذن هو تحديد الروائح الفعالة سلوكيا المفترضة في باقة معقدة. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الاختبار السلوكي مع الروائح المحددة من أجل تحديد فعالية المواد المتطايرة في التوسط في الاستجابة السلوكية للحشرة.