سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في تحديد شركاء التفاعل لبروتين grab two عن طريق استنساخ التعبير عن CD NA ومراقبة التغيرات في بروتين Grab two المسمى بالبروتين الفلوري الأخضر. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مكتبة CD NA من محللات بكتيرية كخطوة ثانية. ثم يتم ترانسفكشن الـ CDNAs في خلايا كلى جنينية بشرية، مما سيؤدي إلى تعبير عن البنية المراسلة جنباً إلى جنب مع الجينات المستهدفة.

بعد ذلك، يتم تحليل الأطباق التي خضعت لعملية ترانسفكشن باستخدام مجهر opera من أجل تصور التغيرات في تموضع grab two عبر الخلايا، وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها تجنيد GFP tagged. Grab two إلى الإندوسومات بوساطة مستقبل عامل نمو البشرة بناءً على المجهر الفلوري. والميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل these two hybrid هي إمكانية تحديد شركاء التفاعل لـ grab two في حالة فسيولوجية تأخذ في الاعتبار التوزيع تحت الخلوي لشركاء التفاعل.

على الرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لتحديد نقل الإشارة بواسطة Grab two، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أنظمة أخرى، مثل البروتينات الأخرى ذات الأهمية. وتتوفر مكتبة CDNA في شكل مستعمرات بكتيرية فردية في مخزونات الجلسرول.

باستخدام أمر re ray في قائمة الاختيار (picker menu) لجهاز Hudson Rapid pick light وبتنسيق 96 بئراً، يتم اختيار المستعمرات البكتيرية من الطبق المصدر وتلقيحها في 1.5 milliliters من lb amp في طبق 96 بئراً عميقاً. يتم إغلاق الأطباق ذات الآبار العميقة بإحكام باستخدام سدادة نفاذة للغازات وتحضينها طوال الليل عند 37 °C في هزاز. وفي اليوم التالي، يتم تدوير الأطباق العميقة التي تحتوي على البكتيريا بسرعة 2000 RPM لمدة 20 دقيقة.

باستخدام محولات الأطباق في جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بسحب الوسط من الآبار مع ترك الراسب البكتيري سليمًا. بعد ذلك، قم بتكوين سطح محطة العمل الآلية Tecan Freedom Evo كما هو موضح هنا. وزع المحاليل المستخدمة لتحضير البلازميد في القنوات من واحد إلى خمسة وضع طبق الآبار العميقة على السطح.

ضع حوضاً متعدد الفتحات يحتوي على محلول alucian بجوار صفيحة الآبار العميقة، وقم بتحميل الرؤوس في رفوف الرؤوس. قم بتجميع مجمع التفريغ (vacuum manifold). توضع صفيحة ربط البلازميد داخل المجمع، وتوضع صفيحة ترشيح البلازميد فوق المجمع. قم بإعادة تعليق الرواسب باستخدام 250 µL من المحلول one.

يتم خلط منظم تعليق Resus عن طريق السحب والدفع بالماصة. يعد التأكد من إعادة تعليق الكريات بالكامل أمراً بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء. ويمكن استخدام جهاز هزاز إذا لم يؤدِ السحب والدفع بالماصة إلى إعادة تعليق الكريات بالكامل.

بمجرد إعادة تعليق الكريات تماماً، يتم تحليل البكتيريا بإضافة 250 microliters من محلول lysis buffer. أغلق الطبق واقلبه للسماح بالخلط الكامل. اضبط المؤقت لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، أضف 350 µL من المحلول الثالث، وهو منظم التعادل. أغلق اللوحة بإحكام واقلبها ثلاث مرات.

انقل نواتج تحلل البكتيريا إلى ألواح ترشيح البلازميد. قم بتطبيق الفراغ لمدة خمس دقائق. أزل لوح الترشيح وضع لوح الربط فوق المجمع.

طبق الفراغ لمدة دقيقة واحدة. أضف 500 µL من محلول الغسيل الإضافي وطبق الفراغ لمدة دقيقتين. أضف 900 µL من محلول الغسيل رقم أربعة وطبق الفراغ لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، أضف 900 µL من محلول غسيل wash buffer solution four مرة أخرى، ثم طبق الفراغ لمدة 15 دقيقة. ضع لوحة تجميع DNA داخل المجمع. أضف 100 µL من Elucian buffer إلى لوحة الربط واتركها للحضن لمدة دقيقتين.

قم بتطبيق الفراغ لمدة 10 دقائق. وأخيرًا، قم بإزالة لوحة التجميع وقياس تركيز DNA باستخدام جهاز NanoDrop 8, 000. عادةً ما يتوقع الحصول على إنتاجية تبلغ حوالي 100 nanograms per microliter باستخدام هذه الطريقة لبدء هذا الإجراء.

بعد عملية تحضير خلايا HEC 2-9-3 عن طريق التربسين والعد، استخدم موزّعاً آلياً لتوزيع 2 × 10⁴ من الخلايا في كل بئر من آبار طبق Perkin Elmer. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و5% CO2 استعداداً لعملية ترنسفكشن.

استخدم جهاز مناولة السوائل الآلي لتحضير المزيج التالي في كل بئر من طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً: 100 nanograms من GFP. أضف اثنين من DNA البلازميد مع 100 nanograms من CD NA في 25 microliters من وسط خالٍ من المصل. بعد ذلك، أضف 25 microliters من وسط خالٍ من المصل يحتوي على 0.5 microliters من transfect في كل بئر، ثم ابدأ الميقاتي لمدة 30 minutes.

بعد مرور 30 دقيقة، يتم نقل 50 µL من مزيج ترانسفكشن cDNA إلى الخلايا، مع استخدام طريقة توزيع لطيفة. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% carbon dioxide.

لبدء عملية الحصول على الصور، قم بتشغيل برنامج opera. اختر علامة تبويب التكوين (configuration) ثم حدد العدسة الشيئية بقوة 20 times ونوع اللوح الصحيح. تأكد من ضبط الطوق (collar) على القيمة الصحيحة في العدسة الشيئية للسماح بالتركيز مع أنواع الألواح المختلفة.

بعد ذلك، اختر علامة تبويب المجهر. حدد التعريض الأول ليكون fite 4 88 laser والتعريض الثاني ليكون UV 365 laser. قم بتفعيل مرشح UV في كلا التعريضين ثم قم بتعيين التعريض.

واحد للكاميرا الأولى والتعريض. اثنان للكاميرا الثانية. اضبط أزمنة التعريض على 800 milliseconds للتعريض الأول، و 40 milliseconds للتعريض الثاني.

ثانياً، اختر التعريض، ثم اضبط ارتفاع التركيز على صفر ميكرون. اختر التركيز بمجرد إتمام عملية التركيز. قم بتعريض الكاميرا الأولى.

قم بضبط ارتفاع التركيز لتحسين مستوى التعرض ثم انقر على "أخذ الارتفاع" (take height). احفظ معلمات التعرض، وكرر العملية للتعرض الثاني. اختر علامة تبويب تعريف التجربة، ثم أنشئ المخطط والمخطط الفرعي.

قم بسحب وإفلات المخطط ذي الصلة، والتعريض الضوئي، والصورة المرجعية، والميل، وملف الاقتصاص، والمخطط الفرعي. احفظ التجربة. اختر علامة تبويب التجربة التلقائية وقم بالتقاط الصور تحت الظروف العادية.

يتمركز البروتين Grab two في جميع أنحاء الخلية. وعند تحفيز مستقبل عامل النمو، ينتقل إلى الغشاء البلازمي ثم يتم إدخاله لاحقاً إلى الأجسام الداخلية (endosomes). في هذا الشكل، تظهر اللوحة العلوية خلايا CO M six التي تم نقل GFP grab two إليها بشكل عابر، وكما هو متوقع، يتوزع الفلورة في جميع أنحاء الخلية.

ومع ذلك، في الخلايا التي تم تحويلها عابرًا باستخدام GFP grab two بالإضافة إلى مستقبل سطح الخلية IT EGFR، ينتقل grab two إلى تراكيب تشبه الأجسام الداخلية (endosomes) كما هو موضح في اللوحة السفلية. وبناءً على ذلك، عند تطبيق مكتبة شاملة للجينوم، يمكن توقع إمكانية تحديد بروتينات سطح خلية جديدة ترتبط بـ grab two. هذه الطريقة ليست مقتصرة على الكشف عن بروتينات سطح الخلية.

على سبيل المثال، يحفز بروتين DYNAMIN two التابع لـ GPA، والمشارك في عملية الالتقاط الخلوي بوساطة grab two، عملية نقل لبروتين grab two. في هذه التجربة، تم إجراء ترانسفكشن مشترك لـ GFP grab two مع DNM two في خلايا HEC 2 93 T. وتظهر الخلايا الموجودة داخل الدوائر الحمراء انتقال GFP grab two إلى تراكيب شبيهة بالأجسام الداخلية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الترسيب المناعي أو المقايسات البيوكيميائية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كان التفاعل مباشرًا أو غير مباشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام استنساخ التعبير من أجل تحديد التفاعلات البروتينية تحت الخلوية.