سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير
أكتوبر 30, 2012
يوصف أسلوب الفرز الفائق المحتوى لتحديد مستقبلات عبر الغشاء الرواية يشير المختصة. هذا الأسلوب هو قابل للتشغيل الآلي على نطاق واسع ويسمح التنبؤات حول في الجسم الحي ملزمة البروتين وتوطين الفرعي الخلوية مجمعات البروتين في خلايا الثدييات.
الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد شركاء التفاعل للاستيلاء على اثنين عن طريق استنساخ تعبير CD NA ومراقبة التغييرات في بروتين الفلورسنت الأخضر الموسوم ب Grab two. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد مكتبة CD NA أولا من المحللات البكتيرية كخطوة ثانية. يتم نقل CDNAs في خلايا الكلى الجنينية البشرية ، مما سيؤدي إلى التعبير عن بناء المراسل جنبا إلى جنب مع الجينات ذات الأهمية.
بعد ذلك ، يتم تحليل الألواح المنقولة على مجهر الأوبرا من أجل تصور التغييرات في الاستيلاء على توطين اثنين في جميع أنحاء الخلايا ، ويتم الحصول على النتائج التي تظهر تجنيد مستقبلات عامل نمو البشرة بوساطة GFP الموسومة. احصل على اثنين من الجسيمات الداخلية بناء على المجهر الفلوري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل هذين الهجينين هي أنه يمكن تحديد شركاء التفاعل للاستيلاء على اثنين في حالة فسيولوجية تأخذ في الاعتبار التوزيع الخلوي لشركاء التفاعل.
حسنا ، على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نقل الإشارة عن طريق الاستيلاء على اثنين. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل البروتينات الأخرى ذات الأهمية. يتم توفير مكتبة CDNA استنساخ بكتيري واحد في مخزون الجلسرين.
بتنسيق 96 جيدا باستخدام الأمر reray في قائمة المنتقي لضوء اختيار Hudson Rapid. اختر المستنسخة البكتيرية من لوحة المصدر وتلقيحها في 1.5 مل رطل أمبير في لوحة بئر عميقة 96. قم بإغلاق ألواح الآبار العميقة بختم نفاذي للغاز واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في شاكر في اليوم التالي ، قم بتدوير ألواح الآبار العميقة التي تحتوي على البكتيريا A 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
باستخدام محولات الألواح في جهاز طرد مركزي منضدي ، قم بشفط الوسائط من الآبار تاركة الحبيبات البكتيرية سليمة. بعد ذلك ، قم بتكوين سطح محطة عمل Tecan Freedom Evo Automation كما هو موضح هنا. قم بتوزيع محاليل تحضير البلازميد في أحواض من واحد إلى خمسة وضع صفيحة بئر عميقة على سطح السفينة.
ضع حوض متعدد الآبار بمحلول ألوسي مجاور لأطراف تحميل لوحة البئر العميقة في رفوف الأطراف. قم بتجميع مشعب الفراغ. يتم وضع لوحة ربط البلازميد داخل المشعب ويتم وضع لوحة مرشح البلازميد أعلى كريات تعليق Resus مع 250 ميكرولتر من المحلول الأول.
المخزن المؤقت لتعليق Resus عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. يعد التأكد من تعليق الكريات تماما أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء. يمكن استخدام شاكر إذا لم يقم الملاعبة لأعلى ولأسفل بتعليق الحبيبات تماما.
بمجرد إعادة تعليق الكريات تماما ، تكمن البكتيريا عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من المحلول إلى مخزن التحلل. أغلق اللوحة واقلبها للسماح بالخلط الكامل. اضبط مؤقتا لمدة دقيقتين.
بعد ذلك ، أضف 350 ميكرولتر من المحلول الثالث. المخزن المؤقت للتحييد. أغلق اللوحة واقلب ثلاث خطوط مرات.
انقل المحللات البكتيرية إلى ألواح مرشح البلازميد. ضع الفراغ لمدة خمس دقائق. قم بإزالة لوحة المرشح وضع لوحة الربط أعلى المشعب.
ضع الفراغ لمدة دقيقة واحدة. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الإضافي وقم بتطبيق المكنسة الكهربائية لمدة دقيقتين. أضف 900 ميكرولتر من محلول الغسيل العازل أربعة وقم بتطبيق الفراغ لمدة دقيقتين.
بعد ذلك ، أضف 900 ميكرولتر من محلول الغسيل العازل أربعة مرة أخرى وقم بتطبيق الفراغ لمدة 15 دقيقة. ضع لوحة جمع الحمض النووي داخل المشعب. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Elucian إلى لوحة الربط واحتضنه لمدة دقيقتين.
ضع الفراغ لمدة 10 دقائق. أخيرا ، قم بإزالة لوحة التجميع وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام NanoDrop 8 ، 000. عادة ما يمكن توقع عائد يبلغ حوالي 100 نانوغرام لكل ميكرولتر بهذه الطريقة لبدء هذا الإجراء.
بعد hec 2 9 3 خلايا ، يتم تحصيلها وحسابها. استخدم موزعا آليا للتوزيع مرتين 10 على الخلايا الأربع في كل بئر من Perkin Elmer. تحتضن لوحة العرض الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للتعداد.
استخدم معالج السوائل الآلي لتحضير المزيج التالي في كل بئر من قاع دائري 96 ، صفيحة بئر 100 نانوجرام من GFP. احصل على اثنين من الحمض النووي البلازميد مع 100 نانوغرام من CD NA في 25 ميكرولتر من وسط الخالي من المصل. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من الوسائط الخالية من المصل التي تحتوي على 0.5 ميكرولتر من الخليط الجيد وابدأ المؤقت لمدة 30 دقيقة.
بعد 30 دقيقة ، انقل 50 ميكرولترا في جهاز الإرسال الجادة CDNA في المزيج إلى الخلايا. باستخدام طريقة الاستغناء اللطيفة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لبدء الحصول على الصور ، ابدأ تشغيل برنامج الأوبرا. حدد علامة تبويب التكوين وحدد هدف 20 مرة ونوع اللوحة الصحيح. تأكد من ضبط الياقة على القيمة الصحيحة على الهدف للسماح بالتركيز بأنواع مختلفة من الألواح.
بعد ذلك ، حدد علامة التبويب المجهر. حدد التعرض الأول على أنه ليزر fite 4 88 والتعرض الثاني على أنه ليزر UV 365. قم بتنشيط مرشح الأشعة فوق البنفسجية على كل من التعريضات الضوئية وتعيين التعريض الضوئي.
واحد للكاميرا واحدة والتعرض. اثنان للكاميرا الثانية. اضبط أوقات التعريض الضوئي على 800 مللي ثانية للتعريض الضوئي وواحدة و40 مللي ثانية للتعريض الضوئي.
ثانيا ، حدد التعريض الضوئي ، وواحد ضبط ارتفاع التركيز على صفر ميكرون. حدد التركيز بمجرد التركيز البؤري. كشف الكاميرا الأولى.
اضبط ارتفاع التركيز البؤري لتحسين مستوى التعريض وانقر فوق التقاط الارتفاع. احفظ معلمات التعريض الضوئي ، كرر للتعرض الضوئي. ثانيا ، حدد علامة تبويب تعريف التجربة ، وقم بإنشاء تخطيط وتخطيط فرعي.
قم بسحب وإسقاط التخطيط والتعرض والصورة المرجعية والانحراف وملف الاقتصاص والتخطيط الفرعي ذي الصلة. احفظ التجربة. حدد علامة تبويب التجربة التلقائية واحصل على الصور في الظروف العادية.
يتم ترجمة الاستيلاء على اثنين في جميع أنحاء الخلية بأكملها. عند تحفيز مستقبلات عامل النمو ، ينتقل إلى غشاء البلازما ويتم استيعابه لاحقا في الجسيمات الداخلية. في هذا الشكل ، تظهر اللوحة العلوية CO M ست خلايا تم نقلها بشكل عابر باستخدام GFP الاستيلاء على اثنين ، وكما هو متوقع ، يتم توزيع التألق في جميع أنحاء الخلية.
ومع ذلك ، في الخلايا التي تم نقلها بشكل عابر باستخدام GFP ، انتزع اثنين بالإضافة إلى مستقبلات سطح الخلية ، انتزاع EGFR ، يتم نقلهما إلى هياكل تشبه الجسيمات الداخلية كما هو موضح في اللوحة السفلية. وبالتالي ، عند تطبيق مكتبة جينوم واسعة ، يمكن توقع تحديد بروتينين على سطح الخلية الملزمين الجديدين. لا تقتصر هذه الطريقة على الكشف عن بروتينات سطح الخلية.
على سبيل المثال ، يؤدي DYNAMIN الثاني من GPA ، والذي يشارك في الاستيلاء على اثنين من الالتقام الخلوي بوساطة ، إلى انتقال الاستيلاء الثاني. في هذه التجربة ، تم نقل GFP اثنين من سرير مع DNM اثنين إلى خلايا HEC 2 93 T. يتضح نقل GFP الاستيلاء على اثنين إلى هياكل شبيهة بالجسيمات الداخلية من خلال الخلايا داخل الدوائر الحمراء.
بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الترسيب المناعي أو المقايسات الكيميائية الحيوية للإجابة على أسئلة أخرى مثل ما إذا كان التفاعل مباشرا أم غير مباشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام استنساخ التعبير من أجل تحديد تفاعلات البروتين تحت الخلوية.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة فحص عالية المحتوى لتحديد المستقبلات الغشائية الجديدة المكونة للإشارات، وهي مناسبة للتشغيل الآلي على نطاق واسع. تمكن الطريقة من التنبؤات المتعلقة بالربط البروتيني في الجسم الحي والموقع تحت الخلوي للمجمعات البروتينية في خلايا الثدييات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- نقل الإشارة
الخلفية
- فهم تفاعلات البروتين ضروري لتوضيح مسارات الإشارات الخلوية.
- قد لا تعكس الطرق التقليدية الظروف الفسيولوجية بدقة.
- يسمح الفحص عالي المحتوى بالتحليل الآلي والفعال.
- يوفر ربط GFP رؤى بصرية حول توطين البروتين.
غرض الدراسة
- تحديد شركاء التفاعل لـ Grab2 باستخدام نسخ الحمض النووي المشفر.
- ملاحظة التغييرات في توطين Grab2 استجابة للمنبهات.
- تحسين الأساليب الموجودة من خلال توفير سياق فسيولوجي لتفاعلات البروتين.
الطرق المستخدمة
- تحضير مكتبة CDNA من المستخلصات البكتيرية.
- تعريب خلايا الكلى الجنينية البشرية بالبنى المبلغة.
- تحليل الخلايا المعبرة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
- أتمتة تحضير البلازميد وعمليات تعريب الخلايا.
النتائج الرئيسية
- يتم توطين Grab2 المرتبط بـ GFP في جميع أنحاء الخلية وينتقل إلى غشاء البلازما عند التحفيز.
- يؤدي التفاعل مع مستقبل عامل النمو البشري إلى التخليط الداخلي في الإندوليسومات.
- نجحت الطريقة في تحديد تفاعلات البروتين في سياق فسيولوجي.
- تشير النتائج إلى تطبيقات محتملة للبروتينات الأخرى ذات الأهمية.
الاستنتاجات
- طريقة الفحص عالي المحتوى فعالة لدراسة تفاعلات البروتين.
- يمكن تطبيق هذه النهج على مسارات إشارات مختلفة تتجاوز Grab2.
- تعزز الأتمتة من كفاءة وقابلية التوسع لعملية الفحص.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Grb2 interaction networks in a physiological context.
- Supports biological de-risking by visualizing subcellular localization and complex formation in live mammalian cells.
- Facilitates functional target validation through quantitative assessment of protein recruitment and relocalization.
- Improves predictive confidence for advancing signaling pathway targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for high-content screening of protein-protein interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative imaging outputs across cDNA libraries.
- Enables scalable, genome-wide identification of novel Grb2-binding proteins for downstream evaluation.
- Supports reliable compound or genetic perturbation screening by providing robust localization readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant signaling pathways by modeling Grb2 recruitment in mammalian cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling follow-up biochemical confirmation.
- De-risks mechanistic assumptions prior to in vivo model investment.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to Grb2 signaling dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing Grb2 complex formation in response to diverse stimuli.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput identification of interaction partners.
- Analytics: Delivers quantitative localization and recruitment metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity into preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and expression cloning platform adaptable to other signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales protein interaction screening in mammalian systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of signaling pathway assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging, cell culture, and molecular cloning.
- Needs access to automated liquid handling, fluorescence microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to various mammalian cell lines and signaling proteins with appropriate construct design.
- Dependent on robust image acquisition and quantitative analysis pipelines for reliable outputs.
