عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

يوصف وسيلة فعالة لعزل الخلايا الليمفاوية من الجهاز التناسلي الماوس. هذه الطريقة يستفيد من إنزيم الهضم وPercoll الفصل المتدرج للسماح العزلة الفعالة. هذا الأسلوب هو أيضا قابلة للتكيف مع لاستخدامها في الأنواع الأخرى

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الليمفاوية عن الجهاز التناسلي للفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الجهاز التناسلي بالكامل أولا وفرم الأنسجة إلى قطع صغيرة لتحرير الخلايا الليمفاوية من الأنسجة. يتم هضم الأنسجة المفرومة ناعما بالكولاجيناز ثمانية وتقليب قوي للأنسجة عند 37 درجة مئوية.

مع تحريك مغناطيسي ، يتم بعد ذلك عزل الخلايا الليمفاوية عن طريق التدرج لكل مكالمة. في النهاية ، يمكن تمييز الخلايا الليمفاوية بقياس التدفق الخلوي امتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الأمراض التناسلية. حيث تسمح لنا هذه الطريقة بفهم سلوك الخلايا الليمفاوية الأنسجية ، والتي غالبا ما تختلف عن الخلايا الليمفاوية المعزولة عن النظام الدائري.

على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لنظام الغشاء المخاطي التناسلي ، إلا أنها يمكن أن تنطبق أيضا على أنظمة أخرى مثل أنظمة الغشاء المخاطي المعوي والجهاز التنفسي. بعد القتل الرحيم لأنثى الفأر ، استخدم مقصا جراحيا لعمل شق منخفض في خط الوسط ثم افتح الجلد. حركي الأمعاء جانبا برفق ، وحددي UCS ، ثم عزلي وأزيلي الجهاز التناسلي بالكامل من UCS إلى المهبل المفتوح.

ضع الجهاز التناسلي في طبق بتري. استخدم مقصا لفتح المسالك بأكملها طوليا. ثم انقل الأنسجة إلى طبق بتري بوسائط RPMI 10 كاملة.

الآن قم بتقطيع الجهاز التناسلي إلى قطع رفيعة ، ثم انقل القطع إلى قارورة تحتوي على RPMI 10 و EDTA الكاملة. ضع القارورة على تحريك مغناطيسي وحرك المنديل مرتين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في كل مرة للتخلص من الخلايا الظهارية بعد فترة التحريك الأخيرة ، وتخلص من المادة الطافية ثم اسكب قطع الأنسجة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل بقايا EDTA بوسائط كاملة.

الآن انقل قطع الأنسجة المفلترة إلى قارورة جديدة مع RPMI 10 الطازجة والكولاجيناز وهضم القطع عند 37 درجة مئوية على التحريك المغناطيسي الذي تم ضبطه لتحريك الأنسجة بقوة بعد ساعة ، صب المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر والحفاظ على تعليق الخلية المصفى على الجليد. أضف RPMI 10 الطازج مع الكولاجيناز إلى القارورة الأصلية وحرك المنديل مرتين أخريين باستخدام RPMI 10 الطازج الكامل والكولاجيناز في كل مرة. بعد الهضم الثالث ، يجب ألا توجد قطع أنسجة مرئية في المحلول.

الآن ، اجمع المواد الطاففية من عمليات الهضم الثلاثة معا. قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 410 جم وأربع درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية. ابدأ بتعليق حبيبات الخلية في حل جديد بنسبة 40٪ لكل مكالمة.

أضف تعليق الخلية بنسبة 40٪ لكل مكالمة في أنبوب متدرج ، ثم قم بتسطيع بعناية وحجم متساو من الطازجة. 70٪ لكل مكالمة. الآن الطرد المركزي لعينات التدرج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانقطاع.

بعد الطرد المركزي ، قم بحصاد الخلايا الليمفاوية بعناية في طبقة الواجهة بين تدرجات البيرول. ثم اغسل الخلايا المستردة باستخدام RPMI من واحد إلى ثلاثة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، بعد التخلص من sup natant ، قم بتعليق الخلايا الليمفاوية في المحلول المناسب وفقا للإجراء التجريبي المطلوب.

هذه المخطط النقطي هي مثال على مجموعة الخلايا الليمفاوية التي تم عزلها من الجهاز التناسلي للفأر المصاب بالكلاميديا يودرم عن طريق المهبل. بعد سبعة أيام من الإصابة ، تم وضع تعليق الخلية المفردة على قرص مضغوط ثلاثة خلايا ليمفاوية إيجابية ، وتم تحليلها بحثا عن الخلايا المضغوطة الأربعة والقرص المضغوط ثمانية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحث لاستكشاف وظيفة الخلايا الليمفاوية التناسلية وخصائص الخلية في نموذج مرض الفئران الفيروسي الذي يحاكي الأمراض البشرية.