التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون

يجمع هذا النهج التجريبي بين دمج BRDU والتهجين الفلوري في الموقع (FISH). وذلك لتحليل توقيت تضاعف الكروموسومات الثديية كمياً. أولاً، يتم دمج BRDU في الخلايا الحية ثم حصد كروموسومات الطور الاستوائي.

بعد ذلك، قم بإجراء تقنية تهجين الحمض النووي الموضعي الفلوري (DNA FISH) مقترنةً بصبغ الأجسام المضادة لـ BRDU المتتابع لتحديد الكروموسومات المتضاعفة الفردية. ثم استخدم المجهر الضوئي لالتقاط صور لإشارات الـ FISH ودمج BRDU في الأشكال الانقسامية الفردية. وباستخدام برنامج CytoVision، احسب مساحة وكثافة البكسلات التي تمثلها إشارات BRDU أو DPI على كل كروموسوم معزول.

يمكن للنتائج قياس ومقارنة دمج BRDU في الكروموسومات المعاد ترتيبها الفردية وholos الخاصة بها. وبما أن الطريقة الموصوفة هنا تقيم الخلايا الفردية، فإن لديها القدرة على اكتشاف التغيرات في التضاعف والتوقيت في عمليات إعادة الترتيب الكروموسومي الموجودة في جزء بسيط فقط من الخلايا في مجموعة ما، مقارنة ببروتوكولات المصفوفات الدقيقة وتسلسل DNA ذات الإنتاجية العالية التي تم تطويرها مؤخراً. وتسمح هذه الطريقة بإجراء مقارنة مباشرة للكروموسومات المتجانسة الموجودة داخل الخلية نفسها.

كما أنها تمتلك القدرة على التحديد القاطع لإعادة ترتيب الكروموسومات التي تؤثر على تضاعف الكروموسومات. وسيقوم ليسلي سميث، وهو باحث مشارك في مختبري، بتوقيت الكروموسومات الكاملة لتوضيح الإجراء. ازرع الخلايا بكثافة تصل إلى 70% تقريباً في طبق زراعة أنسجة بقطر 150 مليمتر، وضعها في حضانة خلايا لمدة 24 ساعة في الوقت المناسب.

النقاط التي تسبق عملية الحصاد. قم بتجديد الوسط بوسط كامل طازج يحتوي على 10 µg/mL من BRDU. وتختلف مدة استزراع الخلايا في وسط يحتوي على BRDU باختلاف نوع الخلايا والنوع الحيوي.

عادةً ما تتراوح مرحلة G2 بين ساعتين وخمس ساعات. قم بإزالة الوسط الزراعي من الطبق مع الاحتفاظ بـ 10 milliliters في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 milliliter. اشطف الخلايا باستخدام 10 milliliters من sine وقم بإزالة ما تبقى من sine عن طريق الشفط الفراغي.

ثم أضف خمسة ملليلتر من 0.25%trypsin واحضنها في درجة حرارة الغرفة حتى تنفصل الخلايا عن الطبق. اجمع الخلايا وانقل المعلق إلى 10 ملليلتر من الوسط الغذائي المحفوظ. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم اسحب كل الوسط الغذائي باستثناء 0.5 ملليلتر.

الآن، قم بإعادة تعليق الخلايا جيداً باستخدام الماصة، ولجعل الخلايا تتورم أسموزياً، أضف ثلاث قطرات من كلوريد البوتاسيوم بتركيز 75 millimolar المسخن إلى 37 °C، ثم اخلط معلق الخلايا باستخدام الماصة. بعد ذلك، أضف 0.5 milliliters إضافية من المحلول ناقص التوتر. الآن، اجعل الحجم الإجمالي للمحلول ناقص التوتر خمسة milliliters واخلط عن طريق السحب بالماصة.

قم بتحضين معلق الخلايا عند 37 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 45 دقيقة اعتماداً على نوع الخلايا. قم بتحضين الأنابيب في وضع مائل للحفاظ على الخلايا في حالة تعليق. ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 400 ×g لمدة 10 دقائق.

قم بشفط السائل الطافي باستثناء 0.5 mm، واستخدم ماصة تحريك باستيل لإعادة تعليق كتلة الخلايا بلطف. ستكون الخلايا المنتفخة اسموزياً هشّة في هذه المرحلة، لذا يجب توخي الحذر لتجنب تمزيق الأغشية السيتوبلازمية. بعد ذلك، أضف ثلاث قطرات من مثبت كارنو واخلط بلطف.

بعد إضافة 0.5 ملليلتر إضافية من المثبت، اجعل الحجم الكلي للمثبت خمسة ملليلترات، واستخدم الماصة للحصول على معلق خلوي متجانس. يمكن تخزين هذه الخلايا المثبتة في الظلام عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لعدة أشهر. قم بحصاد الخلايا المثبتة عن طريق الطرد المركزي، ثم اشفط المثبت وأعد تعليق الراسب في 10 أحجام من المثبت مع الحفاظ على المجهر بارداً جداً على الثلج.

أمل الشريحة بزاوية 45 درجة تقريبًا. أضف معلق الخلايا قطرة تلو الأخرى لتوزيع المعلق. غمر الشريحة بالمثبت ثم قم بتصريف الكمية الزائدة.

بعد ذلك، ضع الشريحة بشكل مسطح على مناشف ورقية لتجف في الهواء. قم بتقييم العينات للتأكد من وجود انتشارات ميتوزية باستخدام مجهر مقلوب. أضف 2 µL من RNase A بتركيز 10 µg/mL في محلول 2X SSC إلى كل شريحة، ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة.

قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل لمدة ثلاث دقائق لكل منها باستخدام محلول 2X SSC بأس هيدروجيني pH 7.0 في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة الماء من العينات عبر سلسلة من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. ثم جفف كل عينة بالهواء في درجة حرارة الغرفة داخل أنبوبة طرد مركزي دقيقة مبردة.

أضف 4 µg من ركيزة DNA ذات النيوكليوتيدات الموُسمة، ومحلول NIC translation buffer بتركيز 10 X، ومزيج DNTP، وإنزيم NIC translation. حضّن التفاعل عند 16 °C طوال الليل، ثم سخنه عند 70 °C لمدة 10 دقائق لإيقاف التفاعل. بعد ذلك، برّده على الثلج لمدة خمس دقائق.

الآن، ولترسيب الحمض النووي DNA باستخدام الإيثانول، أضف 48 µL من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 M، و160 µL من cot 1D NA بتركيز 0.25 µg/µL، و1.2 mL من الإيثانول بتركيز 100%. احفظ العينة عند درجة حرارة -80 °C لمدة تتراوح من 10 دقائق إلى ليلة كاملة، ثم قم بترسيب DNA عن طريق الطرد المركزي واغسل الراسب باستخدام الإيثانول بتركيز 70%. أعد تعليق مسبار DNA المجفف بالهواء في 40 µL من الماء المقطر مرتين للوصول إلى تركيز نهائي قدره 100 ng/µL من labeled back DNA من أجل عملية back SEP simultaneous hybridization. قم بتحضير خليطين منفصلين من مسبارات cot 1D NA كما هو مفصل في المخطوطة المرفقة.

قم بمسخ كوكتيلات المسابير عند 75 °C لمدة 10 دقائق. ثم حضنها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة لربط cot 1D NA بالتسلسلات المتكررة. الآن، اخلط المسبار الخلفي مع المسبار S بنسبة ثلاثة إلى اثنين وبحجم 25 µL لكل عينة.

انقل الشرائح لإجراء عملية مسخ العينات. اغمر الشرائح في محلول 70%form amide و 2XSSC عند درجة حرارة 72 درجة Celsius وحضنها لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة الماء من العينات فوراً عبر سلسلة من الإيثانول عند درجة حرارة 4 درجة Celsius لمدة ثلاث دقائق.

يُجفف كل من العينات بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريباً قبل إتمام تحضير المسبار. يتم موازنة الشرائح على جهاز تسخين الشرائح عند درجة حرارة 45 °C. ثم يُضاف 25 µL من خليط مسبار back S.

ضع غطاء الشريحة برفق فوق كل شريحة، ثم أحكم إغلاق جميع الحواف باستخدام الأسمنت المطاطي لخطوة التهجين. حضن العينات طوال الليل عند 37 °C في غرفة رطبة. أجرِ ثلاث عمليات غسيل بعد التهجين، لمدة ثلاث دقائق لكل منها، في 50% IDE 2X SSC pH 7.0 عند 38 إلى 40 °C.

تعتمد درجة الحرارة المثلى لعمليات الغسل على نوع المسبار المستخدم. فإذا كان هناك تهجين خلفي مرتفع، يتم رفع درجة حرارة عمليات الغسل. وعلى العكس من ذلك، إذا كانت إشارة المسبار ضعيفة مع عدم وجود خلفية، يتم خفض درجة حرارة عمليات الغسل.

قم بإجراء عملية غسل واحدة باستخدام محلول PN المنظم في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. ومن أجل الكشف عن BRDU، أضف 200 microliters من محلول PNM المنظم للحجب إلى كل شريحة. احضن الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، ثم قم بتصفية الشرائح على منشفة ورقية.

ثم أضف 100 µL من الجسم المضاد المقترن anti B-R-D-U-F-E بتركيز 50 µg/mL واحضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. قم بإجراء ثلاث عمليات غسل لمدة ثلاث دقائق في محلول PN buffer في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول PN buffer الزائد من على كل شريحة.

ثم أضف 20 µL من محلول التثبيت dappy Antifa. غطِّ الشريحة بمنشفة ورقية واضغط لأسفل على غطاء الشريحة لطرد فقاعات الهواء ومحلول التثبيت الزائد. التقط الصور باستخدام مجهر فلوري متصل بكاميرا CCD.

باستخدام العدسة الشيئية 100x وعجلة الفلاتر التلقائية وبرنامج cyto vision، يتم التقاط صور BRDU باستخدام فلتر fitzy، وصور صبغات الكروموسومات والمجسات المركزوميرية باستخدام فلتر side three أو Texas red. استخدم أيضاً فلتر dappy لصبغ النوى. حدد الكروموسومات الفردية المطلوبة باستخدام مسابير back EP أو مسابير صبغ خاصة بالكروموسومات في برنامج cyto vision.

قم بقص كل كروموسوم مستهدف من انتشار الطور الاستوائي ككل. انسخ صور كروموسومات DPI وFITZY والصقها في نافذة جديدة. اختر أيقونة الرسم البياني في قائمة الأدوات، والتي تسمح بإنشاء رسم بياني يمثل المساحة والكثافة لكل من تصبغ Fitz وdappy على طول كل كروموسوم على حدة.

يتم ذلك عن طريق رسم خط على طول الكروموسوم من الذراع القصيرة إلى الذراع الطويلة. من قائمة الأدوات، اختر أيقونة البيانات وأنشئ جدولاً يعرض المساحة والشدة المحسوبة لكل من ZI و dpi. بعد ذلك، حدد إشارات ZI و DPI للكروموسومات المستهدفة.

بعد ذلك، انقر على زري الشدة والمساحة في أيقونة الجدول. يقوم البرنامج بإنشاء قياس عددي للبكسلات لكل بوصة مربعة لكل إشارة. بعد ذلك، يتم ضرب متوسط شدة البكسل لكل كروموسوم في المساحة التي تشغلها تلك البكسلات.

للحصول على العدد الإجمالي للبكسلات اللازمة لتصوير أحدث المناطق المتضاعفة في الكروموسومات، قم بتقييم نمط الحزم لدمج BRDU في المناطق المتضاعفة بنشاط من الكروموسومات. ثم احسب الاختلافات في توقيت التضاعف بين أزواج الكروموسومات بناءً على الاختلافات في نمط حزم BRDU. تتضاعف الكروموسومات في الخلايا الثديية وفقاً لبرنامج زمني، حيث يحدث التضاعف المبكر والمتأخر في بداية ونهاية طور S على التوالي.

تستغرق دورة الخلية النموذجية في الخلايا الثديية من ثماني إلى 10 ساعات، وعادة ما تستغرق المرحلة G2 من ساعتين إلى خمس ساعات. في هذا النظام التجريبي، يتم إضافة BRDU لفترات زمنية متزايدة لوسم الأجزاء الأخيرة من الكروموسومات التي تتضاعف؛ حيث تحتوي هذه الخلايا على حذف في جين human as a R six الموجود في الموقع 6Q16.1. بعد المعالجة بـ BRDU لمدة خمس ساعات، تم جمع الخلايا في الطور الميتوزي ومعالجتها لدمج BRDU والتهجين المصبوغ بالفلوريسنت in C2 باستخدام مسبار صبغ الكروموسوم السادس، حيث أظهر الكروموسومان السادسان ثلاث علامات فلورية.

يتفق الاختلاف الملحوظ في نمط نطاقات BRDU مع التأخر في توقيت التضاعف الذي يتجاوز الساعتين لأحد كروموسومات six. ويظهر برنامج Cyto vision ملفات كثافة الإشارة المتباينة لكل من DPI وBRDU على كروموسومَي six، مما يشير إلى تضاعف غير متزامن. بالإضافة إلى ذلك، هناك اختلاف ملحوظ في الكمية الإجمالية لدمج BRDU عند مقارنتها بتحليل مماثل لصبغة DPI.

يوضح إدراج مسبار خلفي يحتوي على جين AR six البشري وجود كروموسوم ستة واحد يحتوي على حذف في ذراعه الطويلة في هذه الخلية. ومن المثير للاهتمام وجود دمج أكثر كثافة لـ BRDU ونمط نطاقات ممتد من دمج BRDU مقارنة بكروموسوم ستة غير المصاب بـ ED. وقد تمت معالجة الانتشارات الميتوزية من سبع خلايا مختلفة لتقدير الفرق في توقيت التضاعف بين كروموسومات ستة.

تظهر مستويات BRDU فرقًا يزيد عن ضعفين بين قيم البكسل الإجمالية للكروموسوم السادس المحذوف والكروموسوم السادس غير المحذوف. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون ثلاثة أيام. نأمل أن يكون لديكم الآن فهم جيد لكيفية قياس توقيت تضاعف الكروموسومات المتماثلة الموجودة داخل الخلية نفسها، وكيفية تحديد إعادة ترتيب الكروموسومات التي ترتبط بتغيرات في التضاعف بشكل لا لبس فيه.

توقيت تضاعف الكروموسومات الكاملة.