تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

يؤسس هذا البروتوكول منصة جديدة للزراعة المشتركة بين المحاور العصبونية والخلايا النجمية (Astroglia) لتحليل التفاعلات بين العصبونات والخلايا الدبقية باستخدام التصوير عالي الدقة. أولاً، يتم تجميع غرفة الزراعة الموائعية الدقيقة، وتجهيز المزارع العصبونية وتحفيز المحاور العصبونية للدخول إلى الجانب الآخر من غرفة الزراعة الموائعية الدقيقة (MCP). بعد ذلك، تُضاف الخلايا النجمية المستزرعة لإنشاء نظام زراعة مشتركة مقسم، حيث يمكن أن يساعد التصوير المتقطع (time-lapse imaging) باستخدام مجهر الفلورة المناعية البؤري في فهم التفاعلات بين المحاور، والخلايا النجمية، والمحاور العصبونية.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول الفصل بين تأثير الزوائد العصبية وإفرازات الخلايا العصبية على تنظيم الـ GT one. وعادةً ما يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في تحفيز المحاور العصبية على الدخول إلى جزء آخر من الحيز الخلوي. يتطلب الأمر كثافة عالية من الخلايا العصبية السليمة المزروعة في الجانب العصبي، مع زرع الخلايا العصبية بالقرب من القنوات المركزية.

صُممت غرف MCP المفتوحة لاستزراع الخلايا في مقصورات لأنواع مختلفة من الخلايا، وتُعد طلاءات البولي يوريثان واللامينين ضرورية لزراعة العصبونات والخلايا النجمية في المزرعة المشتركة. أولاً، ضع محلول بولي يوريثان بتركيز 1 mg/mL في أطباق ذات قاع زجاجي معقمة واحضنها عند 37 °C طوال الليل. اغسل الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلية ثلاث مرات بماء مقطر مزدوج، ثم ضعها تحت غطاء دخان معقم لتجف.

بعد ذلك، قم بطلاء الطبق بـ 1 mg/mL من اللامينين (laminin) وجففه تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة ساعة واحدة. يجب تحضير تجميع منصة المزارع الموائعية الدقيقة (MCP) على الطبق ذو القاعدة الزجاجية حديثاً قبل الاستخدام. ضع منصة المزارع الموائعية الدقيقة بحيث تكون قنوات التوصيل المركزية في الجانب السفلي، وشكّل سدادة محكمة مع الزجاج المطلي.

الأطباق السفلية. أضف أوساط استزراع الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية العادية على كلا جانبي MCP المجمّع. قم بتحضين الغرفة لمدة تتراوح بين ساعتين وأربع ساعات عند 37 درجة مئوية وتحقق من عدم وجود أي تسريب بين MCP والزجاج.

الطبق السفلي. يتم تحضير مزارع الخلايا العصبية القشرية حديثاً من أدمغة الفئران الجنينية التي تتراوح أعمارها بين 14 إلى 16 يوماً. بعد تشريح دماغ الفأر، قم بإزالة السحايا من القشرة المخية تحت مجهر التشريح.

استخدم شفرة حلاقة لتقطيع النسيج إلى كتل نسيجية صغيرة وضع الكتل المقطعة في أنبوب بعد إجراء عملية الطرد المركزي. تخلص من الوسط الموجود فوق الراسب وأضف 0.05%Try لمدة 10 دقائق في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degrees Celsius. قم بفصل الخلايا عن طريق التقليب اللطيف باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار.

مرر العينة عبر مصفاة بمسامية 70 micron لجمع معلق خلايا عصبية صافٍ باستخدام وسط زراعة الخلايا العصبية المكمل بـ 5% FBS. وزع 150 microliters من الخلايا العصبية على الجانب الأيمن من لوحة MCP المجمعة.

كثافة عالية من العصبونات، حيث إن العصبونات التي تلتصق في منطقة استبقاء الخلايا فقط هي القادرة على إنماء محاور عصبية عبر القنوات المركزية وصولاً إلى الجانب الآخر من الـ MCP المجمع. في اليوم التالي، يتم سحب الوسط من منطقة زراعة الخلايا في الحجرة بعناية واستبدال وسط زراعة العصبونات بوسط استزراع عصبي عادي.

أضف 20 nanograms per milliliter من العامل العصبي المشتق من الخلايا الدبقية أو GDNF إلى جانب الخلايا النجمية في الغرفة. يؤدي ذلك إلى تكوين تدرج كيميائي يساعد في تحفيز نمو المحاور العصبية من الجانب العصبي عبر القنوات المركزية لمنصة MCP المجمعة. بعد مرور يومين، راقب المحاور العصبية التي تدخل إلى القناة المركزية.

بمجرد دخول المحاور العصبية إلى القناة المركزية، فإنها عادةً ما تصل إلى الجانب الآخر في غضون يوم واحد. وتظل المحاور العصبية سليمة بشكل طبيعي لمدة أسبوع واحد على الأقل بعد وصولها إلى الجانب الآخر. بعد فصل الدماغ من أجنة الفئران في المراحل P1 إلى P3، يتم استزراع الخلايا النجمية في أطباق بقطر 10 سنتيمتر مغطاة بالبولي يوريثان.

يتم استزراع الخلايا طوال الليل مع تجديد وسط استزراع الخلايا النجمية يومياً خلال اليومين التاليين، ثم مرة كل ثلاثة أيام بعد مرور سبعة أيام، وذلك عندما تشكل الخلايا النجمية طبقة أحادية متلاحمة بنسبة 90%، حيث يتم حصاد الخلايا باستخدام trypsin. بعد حوالي خمسة أيام من زراعة الخلايا العصبية، يتم سحب GDNF. بعد ذلك، يتم استزراع 150 µL من الخلايا النجمية المعاد تعليقها في الجانب الأيسر من MCP المجمّع. وعندما تقترب المحاور من الدخول أو تكون قد دخلت للتو بعد إعادة زراعة الخلايا النجمية، تتفاعل المحاور التي دخلت الجانب الأيسر من MCP المجمّع مباشرة مع الخلايا النجمية، إما عن طريق الاتصال المحوري المباشر أو عبر إطلاق عوامل ذائبة.

راقب الخلايا النجمية للتأكد من التصاقها بمنطقة احتجاز الخلايا. قم بإجراء صبغ مناعي للخلايا في نظام الزراعة المشتركة المقسم إلى حجيرات لتصور بروتينات محددة، مثل تلك المشاركة في التفاعل بين المحاور العصبية والخلايا النجمية. يسمح نظام الزراعة المشتركة المقسم للخلايا العصبية والنجمية للزوائد العصبية فقط، ولا سيما المحاور، بالتفاعل بشكل انتقائي مع الخلايا النجمية.

نصف هنا عملية التنشيط النسخي للمنقل الغلوتاماتي في الخلايا النجمية المستحثة بواسطة المحاور العصبية. تستخدم هذه الدراسات فئرانًا معدلة وراثيًا، تحمل تعبيرًا لمراسل فلوري EGF تحت تحكم المحفز الجيني GT one. يتم استزراع كثافة عالية من الخلايا العصبية في منطقة استبقاء الخلايا في جهاز MCPA المجمع، ويظهر العرض المكبر المحاور وهي تعبر القنوات المركزية وتدخل إلى الجانب الآخر، حيث يكشف صبغ beta three tubulin عن مخروط نمو المحور العصبي.

يسمح نظام MCP بمراقبة حزم المحاور العصبية أثناء نموها عبر القناة المركزية ودخولها من الجانب الآخر. يحدد التلوين المناعي لـ GT one الخلايا النجمية في الجانب الدبقي من نظام MCP الذي ظهر. تعرض الصورة هنا التلامس بين المحاور العصبية والخلايا النجمية الموجبة لـ GLT one.

يرتبط تعبير المراسل EGFP بتنشيط المحفز الداخلي لـ GT one، والتعبير البروتيني، والنشاط الوظيفي. يُظهر تقييم نشاط محفز GT one في الخلايا النجمية المنفردة في C two زيادة ملحوظة في التفاعلية المناعية لـ GLT one في نظام الزراعة المشتركة المقسمة. ومن الأهمية بمكان أن نظام MCP يسمح بالتقاط صور بفاصل زمني لمراقبة التغيرات الديناميكية.

على سبيل المثال، تُظهر هذه البيانات تنشيط محفز GT one الناجم عن المحاور العصبية في الخلايا النجمية من النوع GT one EGFP والعصبونات من النوع البري بعد يوم واحد من زراعة الخلايا النجمية. حيث يُلاحظ وجود حد أدنى من فلورة EGFP. تزداد شدة EGFP بشكل ملحوظ بعد 48 ساعة من الزراعة المشتركة عندما تتوغل المحاور العصبية جيداً في جانب الخلايا النجمية وتتفاعل من خلال الاتصال المباشر مع الخلايا النجمية هنا.

أدى العلاج بالـ Kinine على الجانب العصبي من الـ MCP المُجمّع إلى موت الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام أنه حفز أيضًا تراجع المحاور العصبية وتنكسها، بالإضافة إلى انخفاض فلورة EGFP المحورية. هذه التغيرات الديناميكية في شدة فلورة EGFP استجابةً للمحاور العصبية أثبتت بوضوح أن نشاط محفز Astroglia GT one يتم تنظيمه بواسطة التفاعل المحوري.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نظام زراعة النواة باستخدام منصة الزراعة الموائعية الدقيقة؛ وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون بضعة أيام.