تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

يؤسس هذا البروتوكول منصة جديدة للاستزراع المشترك للمحاور العصبية والخلايا النجمية (Astroglia) لتحليل التفاعلات بين العصبونات والخلايا الدبقية باستخدام التصوير عالي الدقة. أولاً، يتم تجميع غرفة الاستزراع الموائع الدقيقة (microfluidic culture chamber)، وتحضير المزارع العصبونية، وتحفيز المحاور العصبونية للدخول إلى الجانب الآخر من منصة الاستزراع الموائع الدقيقة (MCP). بعد ذلك، تُضاف الخلايا النجمية المستزرعة لإنشاء نظام استزراع مشترك مقسم؛ ويمكن أن تساعد النتائج، بما في ذلك التصوير المسرع (time-lapse imaging) باستخدام مجهر الفلورة المناعية البؤري، في فهم التفاعلات بين المحاور، والخلايا النجمية، والمحاور العصبونية.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عند محاولة الفصل بين تأثير الاستطالات العصبية والإفرازات العصبية في تنظيم GT one. وعادةً ما يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في تحفيز المحور العصبي على الانتقال إلى جزء آخر من الحيز الخلوي. ويتطلب الأمر كثافة عالية من العصبونات السليمة المزروعة في الجانب العصبي، مع زرع العصبونات بالقرب من القنوات المركزية.

صُممت غرف MCP المفتوحة لزراعة أنواع مختلفة من الخلايا في مقصورات منفصلة، وتعد طلاءات البولي يوريثان واللامينين ضرورية لزراعة الخلايا العصبية والخلايا النجمية في المزارع المشتركة. أولاً، ضع محلول بولي يوريثان بتركيز 1 mg/mL في أطباق ذات قاع زجاجي معقمة وتحضن عند 37 °C طوال الليل. اغسل الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلية ثلاث مرات باستخدام ماء مقطر مزدوج، ثم ضعها تحت غطاء سحب أدخنة معقم لتجف.

بعد ذلك، يتم طلاء الطبق باستخدام laminin بتركيز 1 mg/mL وتجفيفه تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة. يجب تحضير تجميع MCP على الطبق ذو القاعدة الزجاجية حديثاً قبل الاستخدام. ضع منصة المزارع الموائعية الدقيقة بحيث تكون قنوات التوصيل المركزية في جانبها السفلي، وقم بتشكيل سدادة محكمة مع الزجاج المطلي.

الأطباق السفلية. أضف أوساط زراعة الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية العادية على كلا جانبي الـ MCP المجمّع. قم بحضن الغرفة لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات عند 37 درجة Celsius وتحقق من عدم وجود أي تسرب بين الـ MCP والزجاج.

الطبق السفلي. يتم تحضير مزارع الخلايا العصبية القشرية حديثاً من أدمغة الفئران الجنينية التي تتراوح أعمارها بين 14 إلى 16 يوماً. بعد تشريح دماغ الفأر، قم بإزالة السحايا من القشرة المخية باستخدام المجهر التشريحي.

استخدم شفرة حلاقة لفرم النسيج إلى كتل نسيجية صغيرة، وضع كتل النسيج المفرومة في أنبوب بعد عملية الطرد المركزي. تخلص من الوسط الموجود فوق الراسب وأضف 0.05%Try لمدة 10 دقائق في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degrees Celsius. قم بفصل الخلايا عن طريق التقليب اللطيف باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار.

مرّر العينة عبر مصفاة بقطر 70 micron لجمع معلق خلايا عصبية رائق باستخدام وسط زراعة الخلايا العصبية المكمل بـ 5%FBS. استزرع 150 microliters من الخلايا العصبية على الجانب الأيمن من لوحة MCP المجهزة.

كثافة عالية من العصبونات، حيث أن العصبونات التي تلتصق في منطقة استبقاء الخلايا فقط هي القادرة على تنمية محاور عصبية عبر القنوات المركزية وصولاً إلى الجانب الآخر من الـ MCP المجمع. في اليوم التالي، يتم سحب الوسط من منطقة زراعة الخلايا في الغرفة بعناية واستبدال وسط زراعة العصبونات بوسط استنبات العصبونات العادي.

أضف 20 ng/mL من العامل العصبي المشتق من الخلايا الدبقية أو GDNF إلى جانب الخلايا النجمية في الغرفة. يؤدي ذلك إلى إنشاء تدرج كيميائي يساعد في تحفيز نمو المحاور العصبية من الجانب العصبي عبر القنوات المركزية لـ MCP المجمعة. بعد مرور يومين، راقب المحاور العصبية التي تدخل إلى القناة المركزية.

بمجرد دخول المحاور العصبية إلى القناة المركزية، فإنها عادةً ما تصل إلى الجانب الآخر في غضون يوم واحد. وعادةً ما تظل المحاور العصبية سليمة لمدة أسبوع واحد على الأقل بعد وصولها إلى الجانب الآخر. بعد فصل الدماغ من صغار الفئران في عمر P1 إلى P3، يتم استزراع الخلايا النجمية في أطباق بقطر 10 سنتيمتر مطلية بالبولي يوريثان.

قم باستزراع الخلايا طوال الليل، ثم استكمل تعويض وسط استزراع الخلايا النجمية يومياً لليومين التاليين، وبعد ذلك مرة كل ثلاثة أيام بعد مرور سبعة أيام، وعندما تشكل الخلايا النجمية طبقة أحادية متلاصقة بنسبة 90%، يتم حصاد الخلايا باستخدام trypsin. بعد حوالي خمسة أيام من زراعة الخلايا العصبية، قم بشفط GDNF. ثم قم ببذر 150 µL من الخلايا النجمية المعاد تعليقها في الجانب الأيسر من MCP المجمع. عندما تكون المحاور العصبية على وشك الدخول أو تكون قد دخلت للتو بعد إعادة بذر الخلايا النجمية، فإن المحاور التي دخلت الجانب الأيسر من MCP المجمع تتفاعل مباشرة مع الخلايا النجمية إما عن طريق الاتصال المحوري المباشر أو إفراز عوامل ذائبة.

راقب الخلايا النجمية للتأكد من التصاقها بمنطقة احتجاز الخلايا. قم بإجراء الصبغ المناعي للخلايا في نظام الزراعة المشتركة المقسم إلى حجرات لتصور بروتينات محددة، مثل تلك المشاركة في التفاعل بين المحاور العصبية والخلايا النجمية. يسمح نظام الزراعة المشتركة المقسم للخلايا العصبية والنجمية بمرور الزوائد العصبية فقط، وخاصة المحاور العصبية، للتفاعل بشكل انتقائي مع الخلايا النجمية.

نصف هنا عملية التنشيط النسخي المحفز بالمحاور لناقل الغلوتامات في الخلايا النجمية. تستخدم هذه الدراسات فئرانًا معدلة وراثيًا، تحمل تعبيرًا لمراسل فلوريسنتي EGF تحت تحكم المحفز الجيني GT1. يتم استزراع كثافة عالية من الخلايا العصبية في منطقة احتجاز الخلايا في جهاز MCPA المجمّع، حيث تُظهر الرؤية المكبرة المحاور وهي تعبر القنوات المركزية وتدخل إلى الجانب الآخر، بينما يكشف صبغ بيتا-3 توبولين عن مخروط نمو المحور العصبي.

يسمح نظام MCP بمراقبة حزم المحاور العصبية أثناء نموها عبر القناة المركزية ودخولها إلى الجانب الآخر. يحدد التلوين المناعي لـ GT one الخلايا النجمية في الجانب الدبقي من نظام MCP الذي ظهر. وتظهر الصورة هنا الاتصال بين المحاور العصبية والخلايا النجمية الإيجابية لـ GLT one.

يرتبط تعبير مراسل EGFP بتنشيط المحفز الداخلي لـ GT one، وتعبير البروتين، والنشاط الوظيفي. أظهر تقييم نشاط محفز GT one في الخلايا النجمية المفردة في C two زيادة ملحوظة في المناعية لـ GLT one في نظام الزراعة المشتركة المقسمة. والأهم من ذلك، يتيح نظام MCP التقاط صور الفاصل الزمني لمراقبة التغيرات الديناميكية.

على سبيل المثال، تُظهر هذه البيانات تنشيطاً للمحفز GT one المستحث بواسطة المحاور العصبية مع الخلايا النجمية GT one EGFP والخلايا العصبية من النوع البري بعد يوم واحد من زراعة الخلايا النجمية. حيث يُلاحظ وجود الحد الأدنى من فلورية EGFP. وتزداد شدة EGFP بشكل ملحوظ بعد 48 ساعة من الزراعة المشتركة، عندما تتغلغل المحاور العصبية جيداً في جانب الخلايا النجمية وتتفاعل من خلال الاتصال المباشر مع الخلايا النجمية هنا.

أدت المعالجة بالـ Kinine على الجانب العصبي من الـ MCP المجمّع إلى موت الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام أنها حفزت أيضاً تراجع المحاور العصبية وتنكسها، بالإضافة إلى انخفاض فلورة EGFP المحورية. وقد أثبتت هذه التغيرات الديناميكية في شدة فلورة EGFP استجابةً للمحاور بوضوح أن نشاط محفز Astroglia GT one يتم تعديله من خلال التفاعل المحوري.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نظام استزراع النواة باستخدام منصة الاستزراع الموائع الدقيقة؛ وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون أيام قليلة.